[發明專利]脫氨酶介導的DNA中N4

在審

• 申請號: 202111409397.6
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114134205A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 袁必鋒;熊軍;馮鈺锜
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

本發明公開了一種脫氨酶介導的DNA中N⁴?甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，屬于生物技術領域。本發明方法利用胞嘧啶脫氨酶A3A蛋白對DNA中正常的胞嘧啶和5?甲基胞嘧啶進行脫氨基，隨后在后續聚合酶鏈式反應擴增形成胸腺嘧啶，而目標分析物N⁴?甲基胞嘧啶能夠抵抗胞嘧啶脫氨酶A3A的脫氨作用，因此在隨后的聚合酶鏈式反應中擴增為胞嘧啶。這樣，只有N⁴?甲基胞嘧啶修飾才能在最終的測序中被讀為胞嘧啶。本發明方法選擇性高，準確性好，無需對DNA樣品進行亞硫酸氫鹽的處理，可直接獲得DNA中N⁴?甲基胞嘧啶的單堿基分辨率圖譜。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法。

背景技術

N⁴-甲基胞嘧啶(4mC)是一種DNA甲基化修飾，主要存在于極度嗜熱菌和部分嗜常溫菌DNA中，在真核生物特別是哺乳動物中目前還沒有報道。迄今為止，已經發現了多種細菌DNA的4mC甲基轉移酶，這些甲基轉移酶能夠與限制性內切酶結合形成序列特異性限制-修飾系統。宿主DNA中的4mC堿基在識別特定基序的限制性內切酶和保護宿主基因組方面起著非常重要的作用。盡管4mC能夠通過液相色譜、液相色譜串聯質譜(LC-MS)等技術高靈敏地被檢測和定量，但它們在基因組DNA中的定位信息一直是一個挑戰。建立4mC的測序技術有助于對其生物學功能進行更加深入的研究。

目前對于DNA中4mC的單堿基分辨率測序方法有兩類，一種是基于傳統亞硫酸氫鹽測序的分析方法，另一種為單分子實時測序(SMRT)方法。亞硫酸氫鹽測序是一種廣泛使用的DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)單堿基分辨率測序方法，由于5mC對亞硫酸氫鹽轉化具有嚴格的抗性，而且5mC廣泛分布于各物種基因組中，因此標準亞硫酸氫鹽測序并不適用于區分5mC和4mC。基于此，有人開發了一種4mC-Tet輔助的亞硫酸氫鹽測序(4mC-TAB-seq) 方法。在4mC-TAB-seq方法中，5mC被Tet蛋白氧化為5-羧基胞嘧啶，后者經亞硫酸氫鹽處理后脫氨，并在測序中讀作胸腺嘧啶。在4mC-TAB-seq方法中，胞嘧啶和5mC都被測序讀為胸腺嘧啶，而只有4mC位點被解讀為胞嘧啶，因此，實現了對整個基因組中4mC的特異性檢測。然而，基于亞硫酸氫鹽的策略需要苛刻的化學脫氨條件，從而導致高達99.9％的DNA 被降解。與二代測序方法不同的是，SMRT技術能夠以單核苷酸分辨率直接檢測修飾堿基，并已被用于DNA中4mC的檢測。然而，與常用的二代測序技術相比，SMRT測序成本更高， DNA用量更大，測序錯誤率相對較高。

人載脂蛋白B mRNA編輯催化亞基3A(A3A)家族酶的成員能夠在單鏈DNA中將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，并在病毒感染和癌癥發生中具有非常關鍵的功能。研究表明，A3A對DNA中的胞嘧啶和5mC具有高效的脫氨活性，且兩種胞嘧啶衍生物5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)和 5-醛基胞嘧啶(5fC)都可以被高效脫氨。A3A的脫氨活性不依賴于序列特異性，因此能夠對全基因組上所有胞嘧啶進行脫氨基。在此基礎上，有研究開發了用于5hmC測序的A3A輔助的定位分析方法，即ACE-seq和AMD-seq。目前，還沒有不依賴于亞硫酸氫鹽處理、高選擇性、操作簡單的4mC定位分析方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種胞嘧啶脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶(4mC)單堿基分辨率定位分析方法，即一種不依賴于亞硫酸氫鹽處理、高選擇性、操作簡單的4mC定位分析方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，包括如下步驟：

(1)對待檢DNA進行變性處理。

(2)經變性處理的DNA用胞嘧啶脫氨酶進行脫氨處理。

(3)脫氨后的DNA樣品進行PCR擴增。