[發明專利]脫氨酶介導的DNA中N4

在審

• 申請號: 202111409397.6
• 申請日: 2021-11-25
• 公開（公告）號: CN114134205A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 袁必鋒;熊軍;馮鈺锜
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

1.一種脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)對待檢DNA進行變性處理；

(2)經變性處理的DNA用胞嘧啶脫氨酶進行脫氨處理；

(3)脫氨后的DNA樣品進行PCR擴增；

(4)將PCR擴增產物測序，待檢DNA中的N⁴-甲基胞嘧啶在測序中被讀為胞嘧啶，正常的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶在測序中被讀為胸腺嘧啶。

2.根據權利要求1中所述的脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：步驟(1)中，DNA變性處理的方法為：在0～60％DMSO存在下，將DNA在90～98℃高溫下孵育2～30分鐘。

3.根據權利要求1中所述的脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：步驟(2)中，所述的胞嘧啶脫氨酶為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的A3A蛋白。

4.根據權利要求3中所述的脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：步驟(2)中，DNA進行脫氨處理的方法為：DNA在含2-(N-嗎啉)乙磺酸10～30mM、Triton X-100 0.05～0.5％、pH 5.5～7.5、A3A蛋白1～10μM的反應體系中，于30～45℃反應0.5～4小時。

5.根據權利要求1中所述的脫氨酶介導的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的單堿基分辨率定位分析方法，其特征在于：步驟(4)中，若PCR擴增得到的是特定序列的DNA片段，擴增產物可以直接進行Sanger測序；若PCR擴增形成DNA文庫，則將擴增產物進行高通量測序。