[發明專利]一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法

在審

• 申請號: 202111408007.3
• 申請日: 2021-11-24
• 公開（公告）號: CN114107175A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 熊春陽;孟繁露;方旭;瞿佳楠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王文思

1.一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，包括：

步驟S1：將細胞與基質膠混合均勻并錨定于培養類器官的類器官培養裝置內；

步驟S2：加入完全培養基，在類器官培養至剛剛形成隱窩時對類器官開始進行機械拉伸，直至類器官培養成熟。

2.根據權利要求1所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S1中所述細胞為人源或動物來源的腸原代隱窩，或為腸類器官傳代過程中被機械打散的碎片，或為通過酶解、分選得到的腸Lgr5-eGFP單細胞。

3.根據權利要求2所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S2中所述完全培養基包括Advanced DMEM/F12，B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生長因子R-Spondinl，Noggin和EGF。

4.根據權利要求3所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，

步驟S1中所述細胞為人源的腸原代隱窩時，所述完全培養基還需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和SB202190；或者

步驟S1中所述細胞為通過酶解、分選得到的腸Lgr5-eGFP單細胞時，所述完全培養基還包括小分子CHIR99021和valproic acid。

5.根據權利要求1所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S1中所述的類器官培養裝置采用可拉伸材料底膜，用于配合機械拉伸的加載。

6.根據權利要求1所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S2中所述在類器官培養至剛剛形成隱窩時對類器官開始進行機械拉伸，是在類器官培養至剛剛“出芽”的狀態時對類器官開始進行機械拉伸，其中對于小鼠原代隱窩需要培養2-3天，對于類器官傳代需要培養1-2天，對于Lgr5單細胞需要培養6-7天。

7.根據權利要求6所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，所述機械拉伸是以氣體壓力或伺服電機作為驅動元件的拉伸裝置來實現單軸、雙軸和周向拉伸。

8.根據權利要求1所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S2中所述加入完全培養基，在類器官培養至剛剛形成隱窩時，還包括將完全培養基替換為不包含R-Spondinl的培養基，然后再繼續執行所述對類器官開始進行機械拉伸，直至類器官培養成熟。

9.根據權利要求8所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，所述不包含R-Spondinl的培養基包括：Advanced DMEM/F12，B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生長因子Noggin和EGF。

10.根據權利要求9所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，

在步驟S1中所述細胞為人源的腸原代隱窩時，所述不包含R-Spondinl的培養基還需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和SB202190；或者

在步驟S1中所述細胞為通過酶解、分選得到的腸Lgr5-eGFP單細胞時，所述不包含R-Spondinl的培養基還包括小分子CHIR99021和valproic acid。

11.根據權利要求1所述的利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養方法，其特征在于，步驟S2中所述類器官培養成熟后，還包括：

收集機械拉伸加載條件下培養的類器官，以靜態培養的類器官作為對照，對拉伸加載條件下培養的類器官的干性相關基因表達水平進行測定，對拉伸加載條件下培養的類器官的細胞增殖情況進行測定，以及對拉伸加載條件下培養的類器官的干性相關蛋白表達情況進行測定。