[發(fā)明專利]一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養(yǎng)方法

在審

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• 申請日: 2021-11-24
• 公開（公告）號: CN114107175A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 熊春陽;孟繁露;方旭;瞿佳楠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王文思

本公開是一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養(yǎng)方法，包括：將細胞與基質膠混合均勻并錨定于培養(yǎng)類器官的類器官培養(yǎng)裝置內；加入完全培養(yǎng)基，在類器官培養(yǎng)至剛剛形成隱窩時對類器官開始進行機械拉伸，直至類器官培養(yǎng)成熟。本公開創(chuàng)新性的將機械拉伸引入腸類器官培養(yǎng)，建立了有機械拉伸參與的類器官動態(tài)培養(yǎng)體系，解決了類器官靜態(tài)培養(yǎng)忽略力學因素的問題，克服了傳統(tǒng)類器官靜態(tài)培養(yǎng)的缺點，挖掘了力學因素在類器官培養(yǎng)中的巨大價值。本公開應用機械拉伸誘導腸類器官生長和腸干細胞干性增強，提高了腸類器官的培養(yǎng)效率，有助于體外培養(yǎng)獲得大尺寸、高成熟度的類器官，對于推動類器官再生生物學領域的研究和應用具有重要意義。

技術領域

本公開涉及類器官體外培養(yǎng)及分析技術領域，具體涉及一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養(yǎng)方法。

背景技術

類器官是利用干細胞的自組織潛能和記憶潛能體外構建的多細胞三維培養(yǎng)物，可以在細胞的類型、組織結構和功能方面模擬其相應的體內器官。近年來，類器官培養(yǎng)技術飛速發(fā)展，已報道成功培養(yǎng)的類器官有腸、肝臟、胃、胰腺、肺、視網膜、大腦、垂體、腎臟、子宮、前列腺、睪丸、內耳、乳腺等類器官，以及各種腫瘤組織類器官。體外培養(yǎng)的類器官在組織創(chuàng)傷修復和器官再生中展現出巨大潛力，也成為組織工程和再生醫(yī)學發(fā)展的重要方向。

世界上首例類器官-小腸類器官的培養(yǎng)體系是由荷蘭科學家Hans Clever建立的。用基質膠Matrigel裹挾原代小腸隱窩或Lgr5腸成體干細胞，在體外成功建立了具有腸結構特征的三維培養(yǎng)物，其包含腸上皮所有的細胞類群，保留了“陷窩-絨毛”形態(tài)結構，可以在體外長期維持，是研究腸上皮穩(wěn)態(tài)的重要工具。

小腸作為重要的消化器官，其表面的粘膜層在正常發(fā)揮生理功能的情況下會受到多種力學因素的影響。例如：腸腔內相對較硬的食糜對腸道帶來的壓力、拉伸和剪切力，腸粘膜腸絨毛有節(jié)奏的運動會帶來循環(huán)應力，此外，腸壁內部的肌肉通過收縮和舒張使得腸蠕動從而引起上皮細胞有節(jié)律的拉伸形變。除了直接影響腸生理功能的發(fā)揮，力學因素還作用于腸上皮生長發(fā)育和形態(tài)發(fā)生。例如，力學因素在腸道發(fā)育中扮演重要角色，腸道回轉、絨毛形成以及腸道干細胞定位都與力學作用直接相關。

現行的腸類器官培養(yǎng)體系是單純依賴生物因素(基質膠、生長因子和培養(yǎng)基)的靜態(tài)三維培養(yǎng)系統(tǒng)，忽略了機械力等物理因素的作用，雖然培養(yǎng)出的類器官在一定程度上能夠在細胞構成和組織結構上概括其對應器官的特征，但是相較于在體內動態(tài)復雜的生化物理環(huán)境中生長發(fā)育的組織器官而言，類器官和其對應器官仍存在較大差距，無法全面有效的模擬體內生理狀態(tài)，因而有必要通過引入機械力因素完善腸類器官培養(yǎng)系統(tǒng)。

發(fā)明內容

本公開旨在提供一種利用機械力誘導腸類器官生長的類器官培養(yǎng)方法。

為達到上述目的，本公開提供了一種利用機械拉伸誘導腸類器官生長的類器官培養(yǎng)方法，包括：

步驟S1：將細胞與基質膠混合均勻并錨定于培養(yǎng)類器官的培養(yǎng)裝置內；

步驟S2：加入完全培養(yǎng)基，在類器官培養(yǎng)至剛剛形成隱窩時對類器官開始進行機械拉伸，直至類器官培養(yǎng)成熟。

上述方案中，步驟S1中所述細胞為人源或動物來源的腸原代隱窩，或為腸類器官傳代過程中被機械打散的碎片，或為通過酶解、分選得到的腸Lgr5-eGFP單細胞。

上述方案中，步驟S2中所述完全培養(yǎng)基包括Advanced DMEM/F12， B27，GlutaMAX，N-acetylcystene，以及生長因子R-Spondin1，Noggin和 EGF。

上述方案中，步驟S1中所述細胞為人源的腸原代隱窩時，所述完全培養(yǎng)基還需加入Gastrin，Nicotinamide，A83-01，prostaglandin E2和 SB202190；或者步驟S1中所述細胞為通過酶解、分選得到的腸Lgr5-eGFP 單細胞時，所述完全培養(yǎng)基還包括小分子CHIR99021和valproic acid。