[發明專利]用于HLA-DR*13基因檢測的引物組、探針、試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202111398643.2
• 申請日: 2021-11-23
• 公開（公告）號: CN113862342A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 林祥華;林澤曦
• 申請（專利權）人: 廈門倍博特醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

本申請公開了一種用于HLA?DR*13基因檢測的引物組、探針、試劑盒及其方法,其屬于生物醫藥工程的技術領域，其中用于HLA?DR*13基因檢測的引物組及其相應探針包括根據HLA?DR*13等位基因特異性設計的引物組和探針，引物組包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和如SEQ ID NO：2所示的反向引物；探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或其互補序列。本申請具有縮短HLA?DR*13基因檢測的時間，提高檢測效率，對HLA?DR*13基因進行高通量檢測的效果。

技術領域

本申請涉生物醫藥工程的技術領域，尤其是涉及一種用于HLA-DR*13基因檢測的引物組、探針、試劑盒及其方法。

背景技術

人類白細胞抗原(HLA)是人類的主要組織相容性復合體(MHC)的表達產物，分布于白細胞表面和全身組織細胞，其決定了機體的組織相容性，是由人體6號染色體上的一組基因調控表達的。HLA的化學本質為一類糖蛋白，由一條被糖基化的α重鏈和一條β輕鏈非共價結合而成，其肽鏈的氨基端向外，羧基端穿入細胞質中，中間疏水部分位于胞膜中。

HLA作為人體組織細胞的遺傳標志，特別是位于免疫細胞上的HLA具有向抗原特異性T細胞受體(TCR)傳遞抗原多態性的生物學特性，在抗原識別、免疫應答以及免疫調控等方面起到重要作用。HLA是人體內首次發現的與疾病有明確關系的遺傳系統，是目前已知最復雜的人類基因復合體，根據功能可將其分為Ⅰ、Ⅱ以及Ⅲ類基因。

其中，Ⅱ類抗原是CD4分子的配體，參與T細胞應答、免疫應答的遺傳控制、約束免疫細胞間的相互作用、抗原呈遞、免疫調節以及免疫細胞分化等過程。在已知HLA的Ⅱ類抗原中HLA-DRB多態性最為復雜，該類抗原的基因編碼區中已經發現了227個以上的等位基因，人體免疫應答基因位于該類抗原的基因編碼區內，人體免疫應答強弱受到HLA-DR基因的控制。最近的研究中發現，HLA-DR基因與慢性重型乙肝肝炎發病進程有密切的關系。

慢性乙肝肝炎是指乙肝病毒(HBV)檢測呈陽性，病程超過半年或發病日期不明確而臨床有慢性肝炎表現者，其臨床表現為乏力、畏食、惡心以及肝區疼痛等癥狀；其中，慢性重癥乙肝肝炎是乙型肝炎常見的致命原因。

人體受到HBV感染后，免疫系統被激活發生免疫應答反應，但是由于機體內免疫應答反應過強，導致免疫系統攻擊自身的肝細胞，導致肝細胞大量壞死和凋亡，導致肝功能衰竭；并且在這過程中，機體的內環境發生改變，使得腸粘膜屏障功能下降，肝臟Kupffer細胞吞噬功能下降，導致體內內毒素增多，激活Kupffer細胞釋放出細胞因子以及炎癥遞質等物質，進而引發肝循環障礙，對肝臟造成二次打擊，使得肝損傷持續存在，并且不斷加重，最終導致慢性重癥乙肝肝炎的發生。

研究認為，人體感染HBV之后病程的發展主要取決于個體的免疫應答狀況，而病毒特異性的T細胞反應對HBV病毒的清除起著關鍵作用，尤其是HLA-DR限制性的特異性CD4+T細胞，其誘導HBV病毒特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應的發生，且輔助B淋巴細胞產生針對HVB外膜和核衣殼的抗原。其中，HLA-DR13能比其他HLA-DR呈遞更多的HBV抗原決定簇，因而能誘導機體發生更強烈的HVB病毒特異性的CD4+T細胞反應，使得機體免疫應答過強導致肝組織細胞的大量壞死和凋亡，導致慢性重癥乙肝肝炎的發生。HLA-DR13基因與乙型慢性肝炎基礎上法還是能的重癥肝炎有密切關系，是一個對判斷病情以及預測病程發展有價值的指標。

目前，HLA-DR*13基因檢測方法主要有Sanger測序法，其利用ddNTP的3’端不含有羥基無法形成磷酸二酯鍵導致DNA合成中斷的原理。在Sanger測序法的過程中，利用一種DNA聚合酶來延伸結合在特定序列模板上的引物，當合成進行到一定程度上后，往反應體系中加入一種熒光標記的ddNTP，產生以不同核苷酸結束的多組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測。使用Sanger測序法進行HLA-DR*13基因檢測具有較高的準確性，但是，Sanger測序法的操作較為繁瑣，所需要的時間較長，不適合高通量的檢測。

發明內容