[發明專利]構建穩定遺傳的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其應用

在審

• 申請號: 202111387603.8
• 申請日: 2021-11-22
• 公開（公告）號: CN114107354A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 申曉林;王曉蕾;袁其朋;王佳;孫新曉
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/52;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

本發明提供了構建穩定遺傳的β?熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其應用。首先，在宿主內整合編碼酪氨酸分解酶、香豆酸輔酶A連接酶、β?肉桂酰羥基化酶、β?肉桂酰氧化酶、β?肉桂酰脫酰酶(phdC)的基因，構建能夠高產對羥基苯甲酸的宿主菌株。其次，在該宿主內整合編碼4?羥基苯甲酸羥化酶和葡萄糖基轉移酶的基因，構建能夠生產β?熊果苷的菌株。最后將編碼核心途徑的基因莽草酸途徑基因整合到上述工程菌的基因組上，同時敲除競爭途徑基因構建了穩定遺傳的β?熊果苷高效生物合成的基因工程菌株，擺脫了應用質粒對工程菌生產造成不穩定的影響，對β?熊果苷的工業化生產極具有應用前景。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及到β-熊果苷高產菌株的構建及其方法和應用。

背景技術

β-熊果苷又稱對苯二酚葡萄糖苷、4-羥基苯基-β-D-吡喃葡糖苷，存在于熊果樹、越橘樹、梨樹、冬青樹等的植物葉子中，具有抑制酪氨酸酶阻止黑色素形成的能力，具有美白護膚的功效，廣泛的應用在醫療和化妝品行業中。獲取熊果苷的方法主要有四種：植物提取法、化學合成法、酶轉化法、生物合成法，植物提取法的生產過程復雜，同時受環境季節的影響，使其產量較低；由于低催化效率和低選擇性，化學合成熊果苷的方法也不是首選；由于氫醌的毒性，抑制酶的活性，并且底物和產物的分離困難，造成能源上的浪費；生物合成法可以葡萄糖為碳源，構建質粒將途徑基因轉化到宿主菌中從頭合成熊果苷，但是質粒的不穩定性遺傳影響生產菌株的活性，使工程化的大腸桿菌維持系數降低。

本發明將部分途徑基因整合到宿主菌的基因組無需表達質粒就可以生產β-熊果苷，提高工程菌株生產功能的穩定性，節約生產成本，同時過表達莽草酸途徑和敲除競爭途徑基因，提高生產熊果苷途徑的碳通量，進而使熊果苷的產量提高原來的1.5倍，生產熊果苷的產量為9.3±0.03g/L。

發明內容

1.本發明的一個目的是提供高產β-熊果苷的基因工程菌。

2.上述基因工程菌，所述的目的菌為大腸桿菌。

3.本發明構建的基因工程菌，通過過表達莽草酸途徑、敲除競爭途徑基因以及整合生產對羥基苯甲酸的途徑基因，構建了一種高產對羥基苯甲酸的基因工程菌株，然后，在該工程菌中整合編碼4-羥基苯甲酸羥化酶(4HB1H)和葡萄糖基轉移酶(TGS)的基因，進而構建了一株高產β-熊果苷的菌株。實驗結果表明，該工程菌株利用葡萄糖、甘油等簡單碳源來生產β-熊果苷能達到9.3±0.03g/L的最終產量。

4.上述高產β-熊果苷的基因工程菌：在宿主內整合編碼酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸輔酶A連接酶(4CL2)、β-肉桂酰羥基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脫酰酶(phdC)的基因，然后在宿主內整合編碼4-羥基苯甲酸羥化酶(4HB1H)和葡萄糖基轉移酶(TGS)的基因，最后在宿主內整合編碼3-脫氧-7-磷酸庚酸合酶(AroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基轉移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因。

5.本發明還提供了一種上述高產β-熊果苷的工程菌的構建方法，包括步驟：

構建基因工程菌株：應用crispr cas9技術在宿主內整合編碼酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸輔酶A連接酶(4CL2)、β-肉桂酰羥基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脫酰酶(phdC)的基因構建能夠生產對羥基苯甲酸的菌株，然后在宿主內整合編碼4-羥基苯甲酸羥化酶(4HB1H)和葡萄糖基轉移酶(TGS)的基因構建能夠生產β-熊果苷的工程菌的菌株，最后在宿主內整合3-脫氧-7-磷酸庚酸合酶(AroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基轉移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因，同時敲除競爭途徑基因trpE和pheA基因，構建一株穩定高產β-熊果苷的工程菌。