[發(fā)明專利]構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111387603.8
• 申請日: 2021-11-22
• 公開（公告）號: CN114107354A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 申曉林;王曉蕾;袁其朋;王佳;孫新曉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/54;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/52;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法，其特征在于：

包括以下步驟：首先，在宿主內(nèi)整合編碼酪氨酸分解酶(TAL)、香豆酸輔酶A連接酶(4CL2)以及β-肉桂酰羥基化酶(phdE)、β-肉桂酰氧化酶(phdB)、β-肉桂酰脫酰酶(phdC)的基因,構(gòu)建熊果苷生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵中間體對羥基苯甲酸的高產(chǎn)菌株；然后在該宿主內(nèi)整合編碼4-羥基苯甲酸羥化酶(4HB1H)和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(TGS)的基因，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定遺傳生產(chǎn)β-熊果苷的基因工程菌株；最后，宿主內(nèi)整合編碼3-脫氧-7-磷酸庚酸合酶(aroG)、3-磷酸莽草酸酯-1-羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶(AroA)、莽草酸激酶(AroL)、分支酸合成酶(AroC)的基因以及敲除trpE和pheA基因，獲得了穩(wěn)定遺傳的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將基因TAL、4Cl2、phdE、phdB、phdC插入到基因pgi之后，基因4HB1H、TGS替換基因組上的假意義基因yneO，基因aroG、aroA、aroL、aroC插入到基因ack的后面。

3.應用權(quán)利要求1所述方法所制備的基因工程菌的應用，其特征在于：將所構(gòu)建的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株涂于無抗生素的平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆到液體LB中培養(yǎng)10h，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃進行發(fā)酵從頭合成生產(chǎn)熊果苷。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高產(chǎn)β-熊果苷的基因工程菌的應用，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括20g/L葡萄糖、20g/L甘油，3g/L酵母粉，1g/L MOPS,5g/L NaHPO₄，1g/L NaCl，3g/LKH₂PO₄，1g/L NH₄Cl，250mg/L MgSO₄，15mg/L CaCl₂，溶劑為水。