[發明專利]一種帶有可視化篩選標記的保加利亞黃皮尖椒遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202111373746.3
• 申請日: 2021-11-19
• 公開（公告）號: CN113897384A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 歐陽樂軍;張艷香;李莉梅;余珠;蘇敏;吳紫汕;林惠純;潘周伶
• 申請（專利權）人: 廣東石油化工學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 程小芳

本發明是一種在自然光下肉眼可視的帶篩選標記的保加利亞黃皮尖椒的遺傳轉化方法，其特征在于：采用保加利亞黃皮尖椒無性系種子萌發的無菌苗子葉，用帶有肉眼可見的紅色蛋白報告基因RUBY的農桿菌對保加利亞黃皮尖椒無性系種子萌發的無菌苗子葉為外植體經愈傷組織培養的轉化，再經不定芽分化、不定芽伸長以及再生苗生根培養、移栽，可以得到自然光下裸眼可見的紅色蛋白報告基因RUBY的再生植株。采用本方法得到的帶紅色蛋白報告基因RUBY的穩定再生植株，為后續對保加利亞黃皮尖椒的基因育種奠定一定的基礎，為植物基因組定點編輯技術在植物改良中的高效利用提供借鑒和參考，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明為一種帶有自然光下可見的篩選標記的保加利亞黃皮尖椒的遺傳轉化方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

辣椒源于拉丁美洲,為茄科中的一種重要農作物,在世界范圍廣泛栽培，在亞熱帶和溫帶地區種植最廣，我國辣椒種植面積約2250 萬畝，占世界辣椒種植總面積的35％，主要分布在海南、廣東、延慶、張家口、甘肅、湖南、河南等地。辣椒營養價值高，富含維生素A、B、C、D、E以及多種礦質元素如鉬、錳、鉀等。由于辣椒富含辣椒堿，使辣椒具有刺激性與藥用價值；從辣椒中提取出的辣椒堿在治療腰椎痛，神經痛，風濕痛以及過敏性鼻炎等癥狀中有明顯作用。通過建立高效穩定的辣椒遺傳轉化體系，

關于辣椒遺傳轉化的研究有很多，Liu等用根瘤農桿菌進行遺傳轉化，轉化外植體上長出芽，但不能誘導芽伸長，未能獲得轉基因植株。如葉志彪等將子葉和農桿菌共培養，再誘導出芽和芽伸長，轉入含卡那霉素的生根培養基，獲得含有目的基因的轉化植株。Murphy 等在建立辣椒原生質體再生植株的基礎上，用電激法介導原生質體轉化Peppermottle potyvirus(辣椒斑駁病毒)和CMV病毒外殼蛋白基因﹐在Numex Rn aky等五個辣椒品種上成功轉化﹔有部分研究者通過“傷口浸染”的方式對辣椒遺傳轉化技術做了深入研究。

其中，農桿菌介導的遺傳轉化是植物轉基因強有力的生物技術工具。農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤或發狀根。根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和 Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。由于其對儀器和操作技術要求較低，被廣泛應用于植物基因工程中，用于研究未知基因功能、各種基因調控原件的機理等。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

RUBY系統是一種可以從產生的紅色推斷出特定基因的表達情況的全新系統，其特點是可以在可見光下直接觀察到表達產物。該系統以甜菜紅素作為報告分子，使用酪氨酸為底物將催化甜菜紅素合成的三種酶的基因CYP76AD1、DODA、GT偶聯到一個開放閱讀框中，組成報告系統RUBY。該系統使用時不用進行特別的處理，有效規避了無菌材料被污染的風險，也不用依賴專用設備或昂貴的耗材，并且能避免因為取樣時的機械外力刺激使相關基因的表達模式受到干擾。

目前，國內外還未見有用紅色蛋白報告基因RUBY的作為可視化篩選標記基因，對保加利亞黃皮尖椒種子無菌苗子葉進行農桿菌轉化，得到帶有可見光下裸眼可見的表達產物呈紅寶石色的報道。本研究通過帶有RUBY基因的農桿菌轉化對植物進行轉化，可實現在植物轉化后對陽性轉化植物的形態學標記篩選，從而成為裸眼可視化篩選標記的轉化方法。

發明內容

本研究提供了一種帶有可見光下可視篩選標記的保加利亞黃皮尖椒遺傳轉化方法，利用報告基因系統RUBY的表達產物呈紅寶石色這個特點，將它運用在沒有該色素背景的保加利亞黃皮尖椒基因工程實驗中。

本發明屬于基因工程技術領域方面的研究，是在可見光下能用肉眼看到紅色篩選標記的一種保加利亞尖椒遺傳轉化方法。其特征在于：解決了定量檢測需要依賴于間接檢測的問題，發明了一種帶有可見光下裸眼可見的篩選標記保加利亞黃皮尖椒遺傳轉化方法。具體步驟如下：