[發明專利]一種帶有可視化篩選標記的保加利亞黃皮尖椒遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202111373746.3
• 申請日: 2021-11-19
• 公開（公告）號: CN113897384A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 歐陽樂軍;張艷香;李莉梅;余珠;蘇敏;吳紫汕;林惠純;潘周伶
• 申請（專利權）人: 廣東石油化工學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 程小芳

1.一種可見光下帶有肉眼可見的篩選標記的保加利亞黃皮尖椒遺傳轉化方法，其特征在于一種可見光下裸眼可視化篩選標記的保加利亞黃皮尖椒遺傳。轉化方法包括以下步驟：

(1)選取成熟的保加利亞黃皮尖椒種子，將辣椒種子用50℃溫水恒溫浸泡20min左右，用無菌水沖洗3～5次后用75％乙醇浸泡60s左右，接著用無菌水沖洗3～5次，再以NaClO浸泡4min左右，最后用無菌水沖洗6～7次，播種于不加激素的培養基上(蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養基+B5100×，pH 5.8～6.0)，暗培養(24±2℃)至種子萌發，然后在24±2℃、光周期12h/d的條件下培養，得到無菌苗；

(2)取12d苗齡的無菌苗，切去子葉上半部分，將帶柄子葉接種于愈傷誘導培養基(MS4.74g/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+6-BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8-6.0)。暗培養一周，培養溫度24±2℃。

(3)愈傷培養后，將愈傷組織置于浸染培養基(MS 4.74g/L+蔗糖30g/L),超聲波震蕩30s后加入帶有紅色蛋白報告基因RUBY的農桿菌，避光于28℃、200r的搖床中搖3h。

(4)將浸染后的愈傷組織轉移到愈傷誘導培養基(MS 4.74g/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+6-BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L+Vc100mg/L，pH 5.8-6.0)上24±2℃暗培養4-5天。

(5)將上述愈傷組織轉移到不定芽分化培養基(MB+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+6-BA5.0mg/L+IAA 0.5mg/L+ABA 0.3mg/L+Spm 100μmol/L+AgNO₃ 5.0mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，24±2℃暗培養1d。然后轉移到24±2℃、光照強度2000-2500lx條件下，光培養1周。

(6)經不定芽培養后，肉眼觀察愈傷組織和發芽的葉片是否帶有明顯紅色。然后將帶明顯紅色的芽的愈傷組織轉移到芽伸長培養基(MB+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+Spm 100μmol/L+AgNO₃5.0mg/L+IAA 0.2mg/L+GA₃1.0mg/L+PBU 0.1mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h/d、光照強度2000～2500lx條件下，培養2-3周。

(7)將得到轉化后的無菌苗轉入生根培養基(MB+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+IAA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+Vc 100mg/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h/d、光照強度2000～2500lx條件下，培養4周。

(8)將生根良好的幼苗從恒溫光照培養箱移至室外自然環境中煉苗7d，揭開封瓶膜在練苗2d，移栽到滅菌的黃心土中生長，得到帶有可見光下裸眼可見的紅色蛋白報告基因RUBY的再生植株。