[發明專利]基于生物素-鏈霉親和素系統的透明質酸酶定量測定方法

在審

• 申請號: 202111370793.2
• 申請日: 2021-11-18
• 公開（公告）號: CN113933507A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 孫菁;黃鵬;劉軍;張弛;劉西燕;張妍;程欣;韓佳迪;單藝瑋;林凡佳
• 申請（專利權）人: 東曜藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 北京三聚陽光知識產權代理有限公司 11250
• 代理人: 張丹錫

本發明涉及基于生物素?鏈霉親和素系統的透明質酸酶定量測定方法，屬于體外診斷技術領域。本發明提供了一種定量測定樣本中透明質酸酶的方法，所述方法先使用偶聯有透明質酸酶抗體的磁珠1捕捉樣本中的透明質酸酶，然后使用偶聯有透明質酸酶抗體的生物素結合捕捉到的透明質酸酶，再使用偶聯有熒光標記的鏈霉親和素標記生物素，最后根據熒光強度值獲得樣本中透明質酸酶的濃度；所述方法基于生物素?鏈霉親和素系統，生物素?鏈霉親和素系統可將樣本中的透明質酸酶信號放大，以便于檢測，因此，所述方法有效提高了透明質酸酶定量測定的準確性和檢測限。

技術領域

本發明涉及基于生物素-鏈霉親和素系統的透明質酸酶定量測定方法，屬于體外診斷技術領域。

背景技術

腫瘤是指生物體內由多種因素導致的其細胞異常生長而引發的疾病，按其對生物體的特性及危害又分為惡性腫瘤和良性腫瘤。惡性腫瘤，又稱為癌癥，有轉移性和浸潤性。惡性腫瘤嚴重威脅人類健康，在人口老齡化、緊張的生活節奏、不良生活習慣以及大氣污染等因素的共同作用下，惡性腫瘤的發病率越來越高，發病年齡越來越年輕化。

胰腺癌是消化道常見惡性腫瘤之一，在腫瘤領域素有“癌癥之王”的稱號。據柳葉刀雜志記載，胰腺癌確診后的五年生存率約10％，是預后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌臨床癥狀隱匿且不典型，是診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源于腺管上皮的導管腺癌。其發病率和死亡率近年來明顯上升。胰腺癌早期的確診率不高，手術死亡率較高，而治愈率很低。本病發病率男性高于女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠較絕經前的婦女多見，絕經后婦女的發病率與男性相仿。

胰腺癌被非常致密的纖維組織所包圍，其中無出其右約10％的細胞是腫瘤細胞，而這些細胞又被透明質酸包圍。透明質酸是一種糖胺聚糖，聚集在腫瘤細胞表面及其周圍空間。在免疫細胞向腫瘤的行進中，透明質酸構成了一道屏障，并壓迫血管、阻礙化療的進行。使用靶向透明質酸的透明質酸酶治療胰腺癌是一種極具前景的胰腺癌治療思路。

PEGPH20靶向的正是透明質酸，它基于一種重組人源透明質酸酶，即rHuPH20酶。這種創新療法，可以降解積聚在胰腺腫瘤周圍的透明質酸，降低腫瘤壓力，使血管更容易輸送氧氣、化療藥物以及腫瘤區域的免疫細胞。在PEGPH20的幫助下，化療或免疫治療制劑，穿透胰腺腫瘤的能力大獲提升，其惡性生長的勢頭也得以遏制。一項名為“HALO202”的II期多中心、隨機臨床研究中，與接受標準化療(納布紫杉醇和吉西他濱)的高水平透明質酸(HA-High)胰腺癌患者相比，PEGPH20聯合納布紫杉醇和吉西他濱的治療方案，在無進展生存期(PFS)上顯示出統計意義上的顯著改善。在此基礎上，找到可靠的定量測定樣本中透明質酸酶的方法，對PEGPH20在臨床上的合理使用極為重要。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種定量測定樣本中透明質酸酶的方法，所述方法包括如下步驟：

捕捉步驟：將樣本與含有磁珠1的工作試劑1混合后進行孵育，得到孵育液1；所述磁珠1上偶聯有透明質酸酶抗體；

結合步驟：將孵育液1與含有生物素的工作試劑2混合后進行孵育，得到孵育液2；所述生物素偶聯在透明質酸酶抗體上；

標記步驟：將孵育液2與含有鏈霉親和素的工作試劑3混合后進行孵育，得到孵育液3；所述鏈霉親和素上偶聯有熒光標記；

重懸步驟：收集并清洗孵育液3中的磁珠1后，將磁珠1重懸于工作試劑4中，得到重懸液；

檢測步驟：測定重懸液的熒光強度值，并根據熒光強度值與透明質酸酶濃度之間的關系，計算樣本中透明質酸酶的濃度。

在本發明的一種實施方式中，所述捕捉步驟前，還包括前處理步驟；所述前處理步驟為：將樣本與含有磁珠2的工作試劑5混合后進行孵育，孵育結束后，去除樣本中的磁珠2，得到經前處理的樣本；所述磁珠2上偶聯有鏈霉親和素。