[發明專利]一種永生化牦牛瘤胃上皮細胞系及其構建方法

有效

• 申請號: 202111366012.2
• 申請日: 2021-11-16
• 公開（公告）號: CN114058592B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 王之盛;王俊梅;胡瑞;王森
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/54;C12N15/38;C12R1/91
• 代理公司: 成都禾創知家知識產權代理有限公司 51284
• 代理人: 裴娟

本發明公開了一種永生化牦牛瘤胃上皮細胞系及其構建方法，所述細胞系保藏編號為：CCTCC?NO.?C2021245，分類命名為：永生化牦牛瘤胃上皮細胞系SV40T?YREC?hTERT。本發明將原代牦牛瘤胃上皮乳頭Ⅰ型膠原酶消化后的組織貼壁培養出原代瘤胃上皮細胞，以此細胞為宿主細胞，用攜帶SV40T和hTERT基因的慢病毒感染細胞，經篩選擴大培養后獲得永生化牦牛瘤胃上皮細胞系，該細胞系的建立解決了原代瘤胃上皮細胞培養難、傳代次數有限的缺陷，豐富了牦牛源細胞系資源；它能穩定傳代，可保持原代瘤胃上皮細胞的形態特征且功能正常，為研究瘤胃上皮營養消化吸收代謝，細胞信號通路機制等提供了有用的體外細胞模型。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種永生化牦牛瘤胃上皮細胞系及其構建方法。

背景技術

牦牛是世界上能夠適應青藏高原地區特殊嚴酷自然環境的特有牛種，是當地牧民賴以生存的重要生活和生產資料，也是牧區脫貧致富的主要支柱產業。我國是世界上牦牛養殖大國，占世界牦牛養殖總量的92％以上，主要分布在我國的西藏、青海、四川、甘肅、云南和新疆等地。有關牦牛的遺傳育種、營養與飼料、疫病防控等基礎研究和應用基礎研究，我國處于世界領先水平。迄今為止國內外對瘤胃的研究越來越多，瘤胃上皮細胞內的調控機制也備受關注。反芻動物在生理結構上不同于單胃動物的最大特點是反芻動物具有復胃結構，在復胃中瘤胃最重要。瘤胃上皮組織是瘤胃內環境與宿主機體環境的重要屏障，瘤胃上皮是瘤胃的主要部位，大量的上皮乳頭從瘤胃表面伸入內腔，極大的增加了吸收揮發性脂肪酸和電解質的表面積，瘤胃上皮層吸收的營養物質是整個動物能量代謝不可或缺的。牦牛作為一種常年生活在青藏高原特殊地域環境中的優勢畜種，其瘤胃代謝與其他反芻動物相比存在許多特異性。然而目前的研究中，牦牛瘤胃上皮細胞的研究較少并且穩定來源的瘤胃上皮細胞系還未建立，制約了對牦牛瘤胃上皮細胞相關的研究，使其相關領域的技術匱乏影響更多分子生物學領域的發展。目前牦牛來源的原代細胞或者細胞系匱乏，獲得更多牦牛來源的細胞系豐富牦牛相關的細胞分子調控機制至關重要。

絕大多數正常細胞被認為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進入衰老狀態。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發生了很大改變。衰老的細胞不能在一些常規的刺激下再誘導細胞分裂，并且衰老細胞的細胞周期分布也比較特殊，不同于一些損傷誘導的細胞休眠，也不同于細胞生長接觸抑制的情況，衰老細胞通常體積變大。研究發現原代牦牛瘤胃上皮細胞在體外培養也出現無法長期傳代保存，傳代次數增加對原代細胞形態和生理功能有嚴重的損害作用。同時數量有限的分離組織，嚴重限制了外源營養物質在細胞水平上的分子表達機制。

公開號為CN107881197A的中國專利公開了一種永生化奶牛瘤胃上皮細胞系及其構建方法，所述構建方法包括如下步驟：步驟a)將采集到的奶牛瘤胃上皮組織在培養基中剪碎清洗消化后進行原代培養，得到瘤胃上皮細胞；步驟b)將步驟a)所述的瘤胃上皮細胞與攜帶SV40T抗原基因的病毒液進行孵育得到感染的瘤胃上皮細胞；步驟c)將步驟b)感染的瘤胃上皮細胞進一步培養得到永生化的奶牛瘤胃上皮細胞系。雖然本發明的永生化奶牛瘤胃上皮細胞系為奶牛瘤胃生理調控和營養吸收機制研究提供試驗細胞模型，培養方法簡單、生長速度快，本發明的構建方法可獲得具有生理功能且能連續傳代的BRECs，但是由于奶牛和牦牛物種的顯著差異，導致該方法培養不出永生化的牦牛瘤胃上皮細胞系。經檢索，關于永生化牦牛瘤胃上皮細胞系的建立至今未有見報道。因此迫切需要建立一株能夠穩定傳代的永生化牦牛瘤胃上皮細胞系，對牦牛的基礎研究有著重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種細胞系功能完整，能維持牦牛瘤胃上皮細胞原有特性的永生化牦牛瘤胃上皮細胞系；

本發明的另一目的在于提供一種操作方法簡單、永生化成功率高的構建永生化牦牛瘤胃上皮細胞系的方法。