[發(fā)明專利]一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111366012.2
• 申請(qǐng)日: 2021-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN114058592B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王之盛;王俊梅;胡瑞;王森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867;C12N15/54;C12N15/38;C12R1/91
• 代理公司: 成都禾創(chuàng)知家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51284
• 代理人: 裴娟

1.一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，所述永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，它包括以下步驟：

S1.樣品前處理：采集成年牦牛的瘤胃上皮組織，清洗干凈后剪取瘤胃乳頭，加入含有抗生素的Hanks溶液清洗干凈；

S2.酶消化及培養(yǎng)：將清洗干凈后的瘤胃乳頭中加入I型膠原酶，37℃恒溫氣浴振蕩30min后，將酶消化后的瘤胃乳頭置于改良的DMEMF/12細(xì)胞完全培養(yǎng)基中4-8min，并將消化后帶有少量培養(yǎng)基的瘤胃乳頭均勻平鋪在鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，各組織塊間距分散，倒置培養(yǎng)皿在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至瘤胃乳頭周圍爬出的細(xì)胞增殖融合至50％時(shí)，去除組織塊并清洗細(xì)胞；其中，所述改良的DMEMF/12細(xì)胞完全培養(yǎng)基為DMEMF/12細(xì)胞完全培養(yǎng)基中還含有200U/ml青霉素，0.2mg/ml鏈霉素，100μg/ml慶大霉素和10％胎牛血清；其中，所述I型膠原酶為濃度為0.1％，I型膠原酶與瘤胃乳頭的體積比為5:1；

S3.純化：將步驟S2中清洗后的細(xì)胞中加入胰蛋白酶的EDTA溶液，放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中消化處理細(xì)胞2min后終止消化，清洗后得到純化的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞；

S4.病毒感染：將純化的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞置于細(xì)胞完全培養(yǎng)基生長(zhǎng)至細(xì)胞70％融合時(shí)，添加攜帶有SV40T和hTERT基因的慢病毒感染細(xì)胞過夜，且慢病毒的MOI＝80，持續(xù)培養(yǎng)4d后添加嘌呤毒素后并持續(xù)培養(yǎng)96h，進(jìn)行篩選細(xì)胞系；其中，所述的細(xì)胞完全培養(yǎng)基為：RPMI-1640+10％FBS+10ng/mL?EGF+2ng/mL?bFGF+2ng/mL?IGF-1+0.5ug/mL氫化可的松+1％青霉素-鏈霉素；

S5.擴(kuò)大培養(yǎng)及傳代：將篩選的細(xì)胞系擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞系生長(zhǎng)覆蓋培養(yǎng)瓶90％時(shí)，加入胰蛋白酶的EDTA溶液消化細(xì)胞，消化至細(xì)胞回縮變圓時(shí)終止消化，得到原代牦牛瘤胃上皮細(xì)胞，原代細(xì)胞傳代至20代以上即為永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S1中所述的抗生素為青霉素、鏈霉素、慶大霉素和兩性霉素B。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3和步驟S5中所述胰蛋白酶的EDTA溶液中胰蛋白酶的含量為0.25％，EDTA的含量為0.02％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S4中所述慢病毒還含有5ug/mL聚凝胺用于增強(qiáng)慢病毒感染效率。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S4中所述SV40T的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是pGMLV-SV40T-PURO，所述hTERT的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為哺乳動(dòng)物基因表達(dá)慢病毒載體pLV[Exp]-Puro-EF1AhTERT。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S5中所述的永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系采用凍存的方式保存，凍存液為完全培養(yǎng)基、FBS和DMSO的混合液，且體積比為：完全培養(yǎng)基:FBS:DMSO＝7:2:1，其中，所述的完全培養(yǎng)基為RPMI-1640+10％FBS+10ng/mL?EGF+2ng/mL?bFGF+2ng/mL?IGF-1+0.5ug/mL氫化可的松+1％青霉素-鏈霉素。