[發(fā)明專利]一種熒光標記適配體金屬有機框架探針的制備方法及其應用

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• 申請日: 2021-11-17
• 公開（公告）號: CN114045329A
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 何俊琳;鄭姝婷;于超
• 申請（專利權）人: 重慶醫(yī)科大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G01N33/53;C12Q1/02;C09K11/06;C08G83/00;G01N21/64
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本發(fā)明涉及一種熒光標記適配體金屬有機框架探針的制備方法及其在汞離子細胞內(nèi)成像領域的應用。其特征在于：以AMCA標記的T20作為離子的識別元件，通過T?Hg²⁺?T結構的形成對汞離子進行識別。用Dabcyl標記的A10與T20雜交，實現(xiàn)熒光信號從無到有。與此同時，Zr?MOFs納米材料作為雜交雙鏈進入細胞的載體。本發(fā)明利用Zr?MOFs納米材料高比表面積的特點，通過鋯不飽和位點和DNA磷酸骨架相結合，吸附更多的DNA雙鏈的同時，也保護DNA雙鏈不被外界復雜環(huán)境降解。本發(fā)明的優(yōu)點在于靈敏度高，特異性強，檢測迅速，方便。

技術領域：

本發(fā)明屬于汞離子細胞內(nèi)成像納米探針的制備與應用領域，具體涉及一種熒光標記適配體金屬有機框架探針的制備方法及其在汞離子細胞內(nèi)成像的應用。

背景技術：

隨著國民經(jīng)濟增長，環(huán)境污染在全世界越來越嚴重，此現(xiàn)狀引起了相關部門的高度重視。其中，重金屬污染對居民健康以及公共安全的危害日益顯現(xiàn)。汞是一種具有蓄積性和多親和性的重金屬元素，其在體內(nèi)的過量蓄積可導致人體免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)的嚴重損害，甚至具有致癌性。我國現(xiàn)已將汞污染納入國家環(huán)境保護重點防控內(nèi)容之一。因此，研究發(fā)展重金屬汞污染物的體外以及細胞內(nèi)的檢測方法，對于汞離子污染的防控具有重要的意義。

目前汞污染物的檢測方法主要有原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等。這些方法大多需要配備昂貴的設備和耗材，且所檢測樣品需要經(jīng)過復雜的前處理來消除其他的干擾物。除此之外，它們還需要技術人員在專門的實驗室進行監(jiān)測分析。因此，開發(fā)快速、簡便且靈敏度高的汞污染物檢測方法是非常必要的。

適配體是短的單鏈寡核苷酸(DNA或RNA)，它們可以通過與特異的目標結合，形成三級結構。適配體具有許多優(yōu)點，例如制造成本低、無批次間的變異、擁有更高的可重復性、更好的熱穩(wěn)定性等。如：富T鏈在汞離子存在的情況下，可以與汞離子形成T-Hg²⁺-T錯配結構，實現(xiàn)對汞離子的識別。利用這個特異性反應原理作為熒光探針構建的理論基礎，就可設計出一種具有高特異性的熒光探針用于汞離子的識別。但由于適配體本身屬于寡核苷酸鏈，容易降解，且其自身所帶的負電荷限制了它進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。

金屬有機框架作為近年來新興的一種納米材料，由于其易于合成、高比表面積、低細胞毒性等特點受到了廣泛的關注。它不僅可以保護DNA鏈不受降解，還可以作為載體運輸適配體進入細胞內(nèi)。我們通過DNA的磷酸骨架與Zr-MOFs上的鋯不飽和位點相結合，使處于猝滅狀態(tài)的T20/A10附載在Zr-MOFs上，合成了汞離子細胞內(nèi)成像探針。

基于上述的思考，本項目建立了一種新型細胞內(nèi)汞離子成像的熒光探針，為汞污染檢測技術的研發(fā)提供實驗依據(jù)，為細胞內(nèi)汞離子污染的監(jiān)測提供新思路和新技術平臺。我們在T20的3’端修飾AMCA熒光基團，并設計與其配對且在5’端修飾Dabcyl猝滅基團的A10，體外構建T20/A10雜交雙鏈，使AMCA熒光基團處于猝滅狀態(tài)。而由于T-Hg²⁺-T之間的作用力大于A-T之間的作用力，富T鏈更傾向于與汞離子形成T-Hg²⁺-T錯配結構。因此，在有汞離子存在的情況下，可以實現(xiàn)熒光探針的熒光信號從無到有，并與汞離子的濃度呈線性相關，用于檢測待測物中汞離子濃度的變化趨勢。在信號探針的制備上，將金屬有機框架Zr-MOFs與T20/A10進行孵育結合。熒光信號探針可以通過胞吞等作用進入細胞內(nèi)部。在細胞內(nèi)磷酸根離子的競爭結合下，T20/A10從Zr-MOFs表面游離出來。T20與汞離子形成“T-Hg²⁺-T”錯配結構，導致熒光基團AMCA遠離猝滅基團Dabcyl，使熒光信號恢復。最終實現(xiàn)對細胞內(nèi)汞離子的成像。

發(fā)明內(nèi)容：

1.本發(fā)明的目的是用于重金屬汞離子污染的細胞內(nèi)成像的熒光探針的制備方法與應用，為汞污染檢測技術的研發(fā)提供實驗依據(jù)，為細胞內(nèi)汞污染的監(jiān)測提供新思路和新技術平臺。其特征包括以下步驟：

(1)Zr-MOFs和T20/A10雙鏈的制備；