[發(fā)明專利]一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111346651.2
• 申請日: 2021-11-15
• 公開（公告）號: CN114149959A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉楊;郝慧琴;李振城;侯藝文;侯鐵錚
• 申請（專利權(quán)）人: 山西中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0786
• 代理公司: 太原申立德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 程園園

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)實驗?zāi)Ｐ脱芯考夹g(shù)領(lǐng)域，針對目前自身免疫性肝炎的嚴(yán)重性以及細(xì)胞模型對自身免疫性肝炎研究的重要性，公開了一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。通過采用刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW 264.7巨噬細(xì)胞株，并將RAW 264.7巨噬細(xì)胞株與BRL3a小鼠肝細(xì)胞共培養(yǎng)，在體外模擬自身免疫性肝炎發(fā)病過程中巨噬細(xì)胞對肝細(xì)胞造成炎性損傷的過程，建立了巨噬細(xì)胞/肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型。彌補了自身免疫性肝炎細(xì)胞模型研究的空白，將自身免疫性肝炎的發(fā)病過程進行分解，聚焦巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的機制，有助于自身免疫性肝炎發(fā)病機制研究，以及治療藥物的篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)實驗?zāi)Ｐ脱芯考夹g(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。

背景技術(shù)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)系由異常自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的肝實質(zhì)炎性病變，可引發(fā)肝硬化及肝衰竭，全球總患病率介于4.0-42.9例/10萬人·年，不同膚色及年齡段人群均可罹患。AIH患者的10年累積死亡率為正常人群的2.29倍(32.3％vs14.1％)；若合并肝硬化或門脈高壓，患者的死亡風(fēng)險顯著升高。重癥AIH患者需進行肝移植以維持生命。據(jù)報道，1995年至2014年間，美國和英國進行肝移植的AIH患者占全部肝移植患者的3.2％和3.6％。因此，AIH被認(rèn)為是除病毒性肝炎外，又一種嚴(yán)重危害人類健康的肝臟炎性疾病。本病的病因以及發(fā)病機制尚不清楚，目前認(rèn)為是由于遺傳易感性及環(huán)境誘發(fā)因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生以T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)為主的針對肝臟抗原的免疫反應(yīng)，造成肝臟組織的破壞及炎癥的形成。

設(shè)計和建立符合人類發(fā)病過程的實驗?zāi)Ｐ?包括用于在體內(nèi)研究的動物模型和用于體外研究的細(xì)胞模型)是深入研究自身免疫性肝炎發(fā)病機制的基礎(chǔ)。自身免疫性肝炎動物模型的相關(guān)研究持續(xù)了近半個世紀(jì)，已有部分動物模型得到了學(xué)界的公認(rèn)。但由于自身免疫性肝炎的免疫炎性反應(yīng)主要發(fā)生在肝臟，肝臟免疫微環(huán)境較為復(fù)雜，誘發(fā)自身免疫性肝炎的因素眾多。對本病發(fā)病機制的研究仍需在細(xì)胞水平進行深入探討，如研究某一個基因參與自身免疫性肝炎發(fā)病過程的機制，需對該基因進行沉默或過表達，通過回復(fù)實驗，以證實該基因是否參與本病的發(fā)生發(fā)展；又如，探討某種藥物是否對自身免疫性肝炎肝損傷具有調(diào)控作用時，有必要探討該藥的作用靶點，同樣需要體外細(xì)胞實驗數(shù)據(jù)的支持。

研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性肝炎發(fā)病過程中，巨噬細(xì)胞除可作為抗原呈遞細(xì)胞參與誘導(dǎo)T細(xì)胞活化外，還可直接參與肝臟炎性損傷過程。因此，如果能夠建立一種穩(wěn)定的、易于復(fù)建且符合自身免疫性肝炎發(fā)病過程的“通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化從而介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷”的細(xì)胞模型，將大大地推進自身免疫性肝炎發(fā)病機制的研究進程。

發(fā)明內(nèi)容

針對目前自身免疫性肝炎的嚴(yán)重性以及細(xì)胞模型對自身免疫性肝炎研究的重要性，本發(fā)明提供了一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：

一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：

步驟1，巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)活化；

步驟2，建立巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

進一步，所述巨噬細(xì)胞為小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞，肝細(xì)胞為小鼠BRL3a肝細(xì)胞。

進一步，所述巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型包括巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞間接共培養(yǎng)細(xì)胞模型、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞直接共培養(yǎng)細(xì)胞模型。

進一步，所述步驟1中巨噬細(xì)胞通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)活化。

更進一步，所述通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)活化巨噬細(xì)胞的具體過程為：24孔板按照每孔1×10⁶/個RAW 264.7巨噬細(xì)胞進行細(xì)胞接種，每孔加入800μL高糖DMEM培養(yǎng)基后，分別加入0-320μg/mL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的刀豆蛋白A在37℃下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞0-24h。