[發(fā)明專利]一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111346651.2 | 申請日: | 2021-11-15 |
| 公開(公告)號: | CN114149959A | 公開(公告)日: | 2022-03-08 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 劉楊;郝慧琴;李振城;侯藝文;侯鐵錚 | 申請(專利權(quán))人: | 山西中醫(yī)藥大學(xué) |
| 主分類號: | C12N5/071 | 分類號: | C12N5/071;C12N5/0786 |
| 代理公司: | 太原申立德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 14115 | 代理人: | 程園園 |
| 地址: | 030619 山西*** | 國省代碼: | 山西;14 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 用于 研究 自身免疫 性肝炎 細(xì)胞 模型 建立 方法 | ||
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)實驗?zāi)P脱芯考夹g(shù)領(lǐng)域,針對目前自身免疫性肝炎的嚴(yán)重性以及細(xì)胞模型對自身免疫性肝炎研究的重要性,公開了一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。通過采用刀豆蛋白A誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系RAW 264.7巨噬細(xì)胞株,并將RAW 264.7巨噬細(xì)胞株與BRL3a小鼠肝細(xì)胞共培養(yǎng),在體外模擬自身免疫性肝炎發(fā)病過程中巨噬細(xì)胞對肝細(xì)胞造成炎性損傷的過程,建立了巨噬細(xì)胞/肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型。彌補了自身免疫性肝炎細(xì)胞模型研究的空白,將自身免疫性肝炎的發(fā)病過程進行分解,聚焦巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的機制,有助于自身免疫性肝炎發(fā)病機制研究,以及治療藥物的篩選。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)實驗?zāi)P脱芯考夹g(shù)領(lǐng)域,具體為一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。
背景技術(shù)
自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)系由異常自身免疫反應(yīng)所介導(dǎo)的肝實質(zhì)炎性病變,可引發(fā)肝硬化及肝衰竭,全球總患病率介于4.0-42.9例/10萬人·年,不同膚色及年齡段人群均可罹患。AIH患者的10年累積死亡率為正常人群的2.29倍(32.3%vs14.1%);若合并肝硬化或門脈高壓,患者的死亡風(fēng)險顯著升高。重癥AIH患者需進行肝移植以維持生命。據(jù)報道,1995年至2014年間,美國和英國進行肝移植的AIH患者占全部肝移植患者的3.2%和3.6%。因此,AIH被認(rèn)為是除病毒性肝炎外,又一種嚴(yán)重危害人類健康的肝臟炎性疾病。本病的病因以及發(fā)病機制尚不清楚,目前認(rèn)為是由于遺傳易感性及環(huán)境誘發(fā)因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生以T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)為主的針對肝臟抗原的免疫反應(yīng),造成肝臟組織的破壞及炎癥的形成。
設(shè)計和建立符合人類發(fā)病過程的實驗?zāi)P?包括用于在體內(nèi)研究的動物模型和用于體外研究的細(xì)胞模型)是深入研究自身免疫性肝炎發(fā)病機制的基礎(chǔ)。自身免疫性肝炎動物模型的相關(guān)研究持續(xù)了近半個世紀(jì),已有部分動物模型得到了學(xué)界的公認(rèn)。但由于自身免疫性肝炎的免疫炎性反應(yīng)主要發(fā)生在肝臟,肝臟免疫微環(huán)境較為復(fù)雜,誘發(fā)自身免疫性肝炎的因素眾多。對本病發(fā)病機制的研究仍需在細(xì)胞水平進行深入探討,如研究某一個基因參與自身免疫性肝炎發(fā)病過程的機制,需對該基因進行沉默或過表達,通過回復(fù)實驗,以證實該基因是否參與本病的發(fā)生發(fā)展;又如,探討某種藥物是否對自身免疫性肝炎肝損傷具有調(diào)控作用時,有必要探討該藥的作用靶點,同樣需要體外細(xì)胞實驗數(shù)據(jù)的支持。
研究發(fā)現(xiàn),在自身免疫性肝炎發(fā)病過程中,巨噬細(xì)胞除可作為抗原呈遞細(xì)胞參與誘導(dǎo)T細(xì)胞活化外,還可直接參與肝臟炎性損傷過程。因此,如果能夠建立一種穩(wěn)定的、易于復(fù)建且符合自身免疫性肝炎發(fā)病過程的“通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化從而介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷”的細(xì)胞模型,將大大地推進自身免疫性肝炎發(fā)病機制的研究進程。
發(fā)明內(nèi)容
針對目前自身免疫性肝炎的嚴(yán)重性以及細(xì)胞模型對自身免疫性肝炎研究的重要性,本發(fā)明提供了一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法。
為了達到上述目的,本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:
一種用于研究自身免疫性肝炎的細(xì)胞模型的建立方法,包括以下步驟:
步驟1,巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)活化;
步驟2,建立巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)模型。
進一步,所述巨噬細(xì)胞為小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞,肝細(xì)胞為小鼠BRL3a肝細(xì)胞。
進一步,所述巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型包括巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞間接共培養(yǎng)細(xì)胞模型、巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞直接共培養(yǎng)細(xì)胞模型。
進一步,所述步驟1中巨噬細(xì)胞通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)活化。
更進一步,所述通過刀豆蛋白A誘導(dǎo)活化巨噬細(xì)胞的具體過程為:24孔板按照每孔1×106/個RAW 264.7巨噬細(xì)胞進行細(xì)胞接種,每孔加入800μL高糖DMEM培養(yǎng)基后,分別加入0-320μg/mL的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的刀豆蛋白A在37℃下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞0-24h。
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