[發(fā)明專利]一種單堿基編輯載體及其構(gòu)建和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111339747.6
• 申請日: 2021-11-12
• 公開（公告）號: CN114045302A
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭紅艷;王磊;李樹磊
• 申請（專利權(quán)）人: 三亞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家南繁研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12N9/22;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京正桓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11979
• 代理人: 李寧寧

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種包含dFnCpf1序列和crRNA序列的單堿基編輯載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。與現(xiàn)有的采用包含Cas9序列的編輯載體相比，本發(fā)明的單堿基編輯載體在目標(biāo)基因靶位點(diǎn)的5’端識(shí)別富含T的PAM[5’?(T)TTN?3’]序列，可以在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集區(qū)域進(jìn)行編輯操作。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單堿基編輯載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)育種中利用的遺傳變異主要來自于自然突變、物理或化學(xué)誘變，存在變異概率低、周期長、位點(diǎn)不可控等缺點(diǎn)。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas)系統(tǒng)作為第三代基因編輯技術(shù)，由單鏈引導(dǎo)RNA(single-guide RNA,sgRNA)與切割靶序列的Cas內(nèi)切核酸酶組成，其主要依賴sgRNA引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶在目標(biāo)基因組位置產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double-strand break,DSB)，而DSB可以通過非同源末端連接(non-homologous endjoining,NHEJ)或同源重組(homology recombination,HR)2種方式進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)過程中會(huì)引起靶標(biāo)位置核苷酸序列的缺失、插入或者替換，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯。

為滿足不同的編輯目的，研究人員以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ)，通過融合表達(dá)Cas9突變蛋白、胞嘧啶脫氨酶或人工進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶，開發(fā)出能夠?qū)Π形稽c(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)單堿基編輯的系統(tǒng)。該系統(tǒng)在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下，實(shí)現(xiàn)胞嘧啶(cytosine,C)轉(zhuǎn)化胸腺嘧啶(thymine,T)/鳥嘌呤(guanine,G)轉(zhuǎn)化腺嘌呤(adenine,A)的替換且通過不斷改進(jìn)大大提高單堿基編輯效率，減少插入和刪除(Insertion and deletion,indel)和非預(yù)期突變。該系統(tǒng)已成功在小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryza sativa)、棉花(Gossypium)、玉米(Zea mays)等物種上實(shí)現(xiàn)安全高效的單堿基替換編輯。但目前該系統(tǒng)僅利用nCas9蛋白突變體(Cas9 nicknase,nCas9)或dCas9蛋白突變體(deactivated Cas9,dCas9)作為效應(yīng)蛋白，所識(shí)別的PAM序列為鳥嘌呤/胞嘧啶富集區(qū)。因此利用現(xiàn)有的堿基編輯系統(tǒng)無法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集區(qū)域進(jìn)行編輯操作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對目前亟需一種可以在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集區(qū)域進(jìn)行編輯操作的系統(tǒng)，提供了一種單堿基編輯載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。

為此，本發(fā)明一方面提供了一種單堿基編輯載體，其包含dFnCpf1序列和crRNA序列。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單堿基編輯載體為dFnCpf1-CBE-BT2，載體結(jié)構(gòu)如圖2B所示。

本發(fā)明另一方面提供了包含本發(fā)明所述的單堿基編輯載體的宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的宿主細(xì)胞為玉米原生質(zhì)體。

本發(fā)明另一方面提供了一種單堿基編輯載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1、構(gòu)建包含dFnCpf1序列的載體；

2、合成包含crRNA序列的表達(dá)框；

3、構(gòu)建包含dFnCpf1序列和crRNA序列的單堿基編輯載體。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的單堿基編輯載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

1、以PB-nCas9-PBE載體為骨架，切除nCas9序列，以pUC57-dFnCpf1載體為模板，擴(kuò)增dFnCpf1序列，將dFnCpf1序列連入線性化的PB-nCas9-PBE載體，構(gòu)建dFnCpf1-PBE載體，并切除OsU3-sgRNA-scaffold表達(dá)框；