[發(fā)明專利]一種單堿基編輯載體及其構(gòu)建和應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111339747.6 | 申請日： | 2021-11-12 |
| 公開（公告）號： | CN114045302A | 公開（公告）日： | 2022-02-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 鄭紅艷;王磊;李樹磊 | 申請（專利權(quán)）人： | 三亞中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家南繁研究院 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/66;C12N9/22;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 北京正桓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11979 | 代理人： | 李寧寧 |
| 地址： | 572024 海南省三亞市崖*** | 國省代碼： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 堿基 編輯 載體 及其 構(gòu)建 應(yīng)用 | ||
1.一種單堿基編輯載體，其包含dFnCpf1序列和crRNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單堿基編輯載體，其為dFnCpf1-CBE-BT2，載體結(jié)構(gòu)如圖2B所示。
3.包含權(quán)利要求1或2所述的單堿基編輯載體的宿主細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其為玉米原生質(zhì)體。
5.一種單堿基編輯載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：
(1)構(gòu)建包含dFnCpf1序列的載體；
(2)合成包含crRNA序列的表達(dá)框；
(3)構(gòu)建包含dFnCpf1序列和crRNA序列的單堿基編輯載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單堿基編輯載體的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：
(1)以PB-nCas9-PBE載體為骨架，切除nCas9序列，以pUC57-dFnCpf1載體為模板，擴(kuò)增dFnCpf1序列，將dFnCpf1序列連入線性化的PB-nCas9-PBE載體，構(gòu)建dFnCpf1-PBE載體，并切除OsU3-sgRNA-scaffold表達(dá)框；
(2)選擇OsU6啟動子，mature-crRNA序列，合成OsU6-crRNA-polyT表達(dá)框，并放入pUC57-simple載體；
(3)設(shè)計包含玉米bt2基因靶序列及同源臂的引物，以O(shè)sU6-crRNA-polyT載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，連入經(jīng)酶切線性化的dFnCpf1-PBE載體，構(gòu)建dFnCpf1-CBE-BT2載體。
7.權(quán)利要求1或2所述的單堿基編輯載體在對靶序列上特定堿基進(jìn)行定向替換中的應(yīng)用，其能夠識別TTN作為原型間隔序列毗鄰基序(PAM)，并對靶位點(diǎn)進(jìn)行單堿基編輯。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述單堿基編輯發(fā)生在靶位點(diǎn)5’端8-12bp的編輯框內(nèi)，單堿基編輯類型是將鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶(T)，或者將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)換為腺嘌呤(A)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述的單堿基編輯為將靶位點(diǎn)5’端第11位堿基的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)換為腺嘌呤(A)。
10.采用權(quán)利要求1或2所述的單堿基編輯載體轉(zhuǎn)化的植物體，優(yōu)選玉米，更加優(yōu)選玉米原生質(zhì)體。
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