[發明專利]一種表達狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202111336759.3
• 申請日: 2021-11-12
• 公開（公告）號: CN114085860A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 崔曉辰;馬鳳龍;曹雷;李光偉;鄭建楠;申識川;邢洪強
• 申請（專利權）人: 青島國脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/56;C12N9/00;A61K39/205;A61P31/14
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本發明提供一種表達狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構建方法及應用，屬于生物工程技術領域，本發明的重組表達載體為食品級狂犬病毒g蛋白重組表達載體；將該重組載體電轉進食品級乳酸乳球菌MG1363中獲得可菌體表面展示表達狂犬病毒g蛋白的食品級重組乳酸乳球菌。將其制成疫苗，可以通過口服途徑免疫機體產生抗狂犬病毒中和抗體。本發明將pgsA基因進一步構建到重組載體上，可以使表達的狂犬病毒g蛋白錨定在乳酸菌表面。本發明可以實現新一代的口服狂犬疫苗，完成狂犬疫苗從注射到口服的完美轉型，為實現消除由狗引發的人類狂犬病的全球目標有力保障。口服疫苗安全，可通過胃腸黏膜進行抗原遞呈，刺激機體產生中和性抗體，較傳統注射途徑免疫效果好。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體地說是一種表達狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構建方法及應用。

背景技術

狂犬病是由狂犬病毒引起的高度嗜神經性人畜共患急性傳染病，流行廣、宿主多，幾乎所有溫血動物都可感染，以各種哺乳動物為主要宿主。由于野生動物疫源地的存在加之一些其它因素，根除該病一直比較困難。目前該病流行于世界上一百多個國家和地區，據世界衛生組織報道，每年死于狂犬病的人數超過5.5萬人，其中約95％發生在亞洲和非洲，我國狂犬病發病率已由2007年的3300例逐年下降至2020年的179人。本病病死率幾乎100％，大多數死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致，受害者中30％～60％為15歲以下兒童。感染狂犬病病毒后應及時進行清創和免疫，否則一旦開始出現狂犬病的體征和癥狀，就無藥可治。

狂犬病分布于全球野生動物及大部分發展中國家家養犬中，對傳染性動物進行疫苗免疫是全球預防人類狂犬病最具效益的方法。狂犬疫苗作為對抗狂犬病的惟一有效方法，經歷了漫長發展過程。目前狂犬疫苗主要以細胞培養疫苗和減毒活疫苗等注射型疫苗為主。由于價格和產量的原因，主要用于暴露后免疫，若使用減毒活疫苗，注射后還存在發生狂犬病的潛在危險。

發明內容

本發明的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種表達狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構建方法及應用。

本發明的技術方案是按以下方式實現的，本發明的一種表達狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構建方法及應用，

其狂犬病毒G蛋白重組表達載體，所述該重組表達載體的可表達基因中至少包含有狂犬病毒G蛋白基因。

該重組表達載體的可表達基因中還包含有pgsA基因。

狂犬病毒G蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2；

pgsA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3。

該重組表達載體采用不含抗性基因篩選標記的重組表達載體。

不含抗性基因篩選標記的重組表達載體為經過改造不含有紅霉素抗性基因的pMG36e載體；

不含有紅霉素抗性基因的pMG36e載體的改造方法：

步驟(1)以嗜酸乳桿菌總RNA為模板，設計含有酶切位點的特異性引物，克隆β-半乳糖甘酶基因lacZ；

步驟(1)中，含有酶切位點的特異性引物：

P1：5'-GCGAATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTATCACG-3'；

P2：5'-AAAAGAATTCCTAATTTCTCAATACTTGAACATCC-3'；

步驟(2)根據pMG36e載體序列設計含有酶切位點的特異性引物，擴增除紅霉素抗性基因以外的片段；

步驟(2)中，含有酶切位點的特異性引物：

P3：5-TACGTCGATCGAATTCGGTCCT-3'；