[發(fā)明專利]一種表達(dá)狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111336759.3
• 申請日: 2021-11-12
• 公開（公告）號: CN114085860A
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔曉辰;馬鳳龍;曹雷;李光偉;鄭建楠;申識川;邢洪強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 青島國脈生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/56;C12N9/00;A61K39/205;A61P31/14
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本發(fā)明提供一種表達(dá)狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明的重組表達(dá)載體為食品級狂犬病毒g蛋白重組表達(dá)載體；將該重組載體電轉(zhuǎn)進(jìn)食品級乳酸乳球菌MG1363中獲得可菌體表面展示表達(dá)狂犬病毒g蛋白的食品級重組乳酸乳球菌。將其制成疫苗，可以通過口服途徑免疫機(jī)體產(chǎn)生抗狂犬病毒中和抗體。本發(fā)明將pgsA基因進(jìn)一步構(gòu)建到重組載體上，可以使表達(dá)的狂犬病毒g蛋白錨定在乳酸菌表面。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)新一代的口服狂犬疫苗，完成狂犬疫苗從注射到口服的完美轉(zhuǎn)型，為實(shí)現(xiàn)消除由狗引發(fā)的人類狂犬病的全球目標(biāo)有力保障。口服疫苗安全，可通過胃腸黏膜進(jìn)行抗原遞呈，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，較傳統(tǒng)注射途徑免疫效果好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種表達(dá)狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

狂犬病是由狂犬病毒引起的高度嗜神經(jīng)性人畜共患急性傳染病，流行廣、宿主多，幾乎所有溫血動物都可感染，以各種哺乳動物為主要宿主。由于野生動物疫源地的存在加之一些其它因素，根除該病一直比較困難。目前該病流行于世界上一百多個國家和地區(qū)，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年死于狂犬病的人數(shù)超過5.5萬人，其中約95％發(fā)生在亞洲和非洲，我國狂犬病發(fā)病率已由2007年的3300例逐年下降至2020年的179人。本病病死率幾乎100％，大多數(shù)死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致，受害者中30％～60％為15歲以下兒童。感染狂犬病病毒后應(yīng)及時進(jìn)行清創(chuàng)和免疫，否則一旦開始出現(xiàn)狂犬病的體征和癥狀，就無藥可治。

狂犬病分布于全球野生動物及大部分發(fā)展中國家家養(yǎng)犬中，對傳染性動物進(jìn)行疫苗免疫是全球預(yù)防人類狂犬病最具效益的方法。狂犬疫苗作為對抗狂犬病的惟一有效方法，經(jīng)歷了漫長發(fā)展過程。目前狂犬疫苗主要以細(xì)胞培養(yǎng)疫苗和減毒活疫苗等注射型疫苗為主。由于價格和產(chǎn)量的原因，主要用于暴露后免疫，若使用減毒活疫苗，注射后還存在發(fā)生狂犬病的潛在危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種表達(dá)狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的一種表達(dá)狂犬病毒g蛋白的重組乳酸菌、構(gòu)建方法及應(yīng)用，

其狂犬病毒G蛋白重組表達(dá)載體，所述該重組表達(dá)載體的可表達(dá)基因中至少包含有狂犬病毒G蛋白基因。

該重組表達(dá)載體的可表達(dá)基因中還包含有pgsA基因。

狂犬病毒G蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2；

pgsA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3。

該重組表達(dá)載體采用不含抗性基因篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體。

不含抗性基因篩選標(biāo)記的重組表達(dá)載體為經(jīng)過改造不含有紅霉素抗性基因的pMG36e載體；

不含有紅霉素抗性基因的pMG36e載體的改造方法：

步驟(1)以嗜酸乳桿菌總RNA為模板，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的特異性引物，克隆β-半乳糖甘酶基因lacZ；

步驟(1)中，含有酶切位點(diǎn)的特異性引物：

P1：5'-GCGAATTCTAGAGGAAATAAAATGACACAATTATCACG-3'；

P2：5'-AAAAGAATTCCTAATTTCTCAATACTTGAACATCC-3'；

步驟(2)根據(jù)pMG36e載體序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的特異性引物，擴(kuò)增除紅霉素抗性基因以外的片段；

步驟(2)中，含有酶切位點(diǎn)的特異性引物：

P3：5-TACGTCGATCGAATTCGGTCCT-3'；