[發明專利]缺失十二個基因的減毒非洲豬瘟病毒株的構建及其作為疫苗的應用

有效

• 申請號: 202111335696.X
• 申請日: 2021-11-11
• 公開（公告）號: CN114107228B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 鄭海學;馮濤;李攀;劉華南;石正旺;馬昭;申超超;齊曉蘭;吳盼雪;張克山;李丹;黨文;楊波;王琦;曹麗艷;朱紫祥;田宏;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 毛婷

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種缺失十二個基因的減毒非洲豬瘟病毒株及作為疫苗的應用。本發明在ASFV?CN/GS?2018病毒中聯合缺失G?ACD?00190、MGF?110?9L、G?ACD?00210、MGF?360(9L、10L、11L、12L、13L、14L)、MGF?505(1R、2R、3R)基因，降低了親本毒株的毒性，獲得了一株減毒非洲豬瘟疫苗株；所述減毒非洲豬瘟疫苗株免疫豬后對豬完全致弱、免疫豬健康、免疫后在豬血液內檢測不到病毒的存在，且能夠對ASFVCN/GS/2018強毒株攻毒提供100％免疫保護，可作為安全有效的防控非洲豬瘟疫情的候選疫苗，具有極大的社會價值。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種缺失十二個基因的減毒非洲豬瘟病毒株Δ20/M9的構建及其作為疫苗的應用。

背景技術

非洲豬瘟(African?Swine?Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)感染引起的一種以豬發熱和豬全身臟器出血為特征的急性烈性傳染病，對于家豬的病死率高達100％。該病首先于1921在肯尼亞爆發，隨后在整個非洲的家豬和野豬中廣泛流行。20世紀50年代傳入歐洲，整個歐洲用了40年消除該病。然而，該病自2007年再次從東非傳入格魯吉亞，隨后便廣泛在東歐散播，并于2017年傳入俄羅斯遠東地區伊爾庫斯克。2019年8月初，扈榮良研究員率先報道我國第一例非洲豬瘟疫情，短短一年之內，該病蔓延至全國30個省市自治區，繼續對養豬業構成威脅，其中與2018年8月相比，2019年9月中國生豬產量下降了40％，豬肉價格自2019年8月以來上漲了一倍，已造成全國40％以上減產率，損失嚴重。當前沒有商品化的有效疫苗，非洲豬瘟疫情一旦發生，只能通過撲殺手段進行控制，但是這種方式不僅導致經濟損失，無法滿足我國規模化養豬的需要。因此，疫苗作為預防和控制病毒傳染病最有效、最經濟的手段，對于我國規模養豬模式下的非洲豬瘟的防治至關重要。但非洲豬瘟病毒(ASFV)結構復雜、基因組龐大，大部分功能未知，感染與致病機制不清，疫苗創制的理論認知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗問世。

目前對于非洲豬瘟疫苗的制備主要通過三種方式：一是直接對原始非洲豬瘟病毒進行滅活得到滅活疫苗；二是篩選出有效誘導免疫應答的病毒蛋白，進而制備亞單位疫苗和活載體疫苗；三是采用基因缺失手段，敲除毒力基因后獲得重組病毒疫苗。其中第一種方法是制備病毒疫苗最常用、最直接的方法，但是，由于非洲豬瘟病毒編碼免疫抑制、免疫耐受和抗體依賴增強作用(ADE)等蛋白，滅活疫苗免疫豬內無法提供有效的免疫保護作用；第二種方面是非洲豬瘟病毒結構復雜，目前誘導免疫應答的蛋白還未清楚，獲得的抗原還不足以誘導堅強的免疫保護作用。而目前最有望突破的疫苗就是基因敲除疫苗，通過對免疫抑制、耐受、ADE等毒力相關基因的敲除，獲得既具有免疫原性，又能降低致病性，免疫豬獲得免疫保護作用的疫苗候選毒株。

對于豬瘟病毒毒力基因的敲除，往往需要考慮到對豬的免疫應答和保護性，又要兼顧致病性和安全性能。但是現有技術中豬瘟病毒毒力基因敲除疫苗還考量如下因素：(1)敲除的毒力基因是否減少帶毒、排毒，是否帶來組織損傷和影響生產性能等是生物安全的一個重要指標，也是基因缺失疫苗安全性不斷提升的一個重要指標；(2)不同毒株缺失同一基因產生的效果不同，缺失不充分存在毒力和致病性殘留問題；以及多基因缺失造成的病毒滴度低，也會使致弱毒株降低免疫原性或保護作用等風險；(3)非洲豬瘟的全基因組測序工作雖然已經完成，但是組成非洲豬瘟病毒的調控基因和結構基因高達160多個，雖然工程巨大，但對調控基因和結構基因的功能對其致病機理和疫苗研制至關重要；(4)聯合敲除毒力基因的選擇至關重要，不同選擇配合會產生不同甚至相反的免疫保護效果。