[發(fā)明專利]一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111326362.6
• 申請日: 2021-11-10
• 公開（公告）號: CN114107097A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 暴連群;劉中須;祁桂玲;候慧云;劉天嬌;王學偉
• 申請（專利權(quán)）人: 河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N3/00;C12R1/465
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 郜彥茹

1.一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1、阿佛曼鏈霉菌的菌種制備：

將冷凍保藏的阿佛曼鏈霉菌菌種接種于茄子瓶斜面培養(yǎng)基上，于28-30攝氏度培養(yǎng)7天，備用；

步驟2、固體發(fā)酵培養(yǎng)：

步驟2-1、配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基，并滅菌；

步驟2-2、取步驟1制備的茄子瓶斜面菌種，用無菌水制成菌種懸浮液；

步驟2-3、將菌種懸浮液均勻接種于步驟2-1制備的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中；

步驟2-4、在臥式固態(tài)生物反應器進行固體發(fā)酵培養(yǎng)，時間9-11天，至每克物料中活孢子數(shù)量大于等于50億個后，停止發(fā)酵；固體發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：無菌空氣通氣量1：0.2-0.5v/v/min；反應器壓力：0.005-0.01MPa，培養(yǎng)溫度28-30攝氏度，培養(yǎng)濕度50-60％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，還包括步驟3、活孢子粉的制備：

將步驟2發(fā)酵結(jié)束的固體培養(yǎng)物移入雙錐旋轉(zhuǎn)鼓風式干燥機中干燥，至物料含水量小于等于10％后，粉碎成60-80目的粉末，即得阿佛曼活孢子粉。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，所述茄子瓶斜面培養(yǎng)基，包括如下質(zhì)量百分比的各原料：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，磷酸二氫鉀0.05％，硫酸鎂0.03％，瓊脂1.8-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，所述茄子瓶斜面培養(yǎng)基在接種前還需要滅菌，所述茄子瓶斜面培養(yǎng)基的滅菌條件為：于0.11-0.12MPa壓力下120攝氏度濕熱消毒滅菌30min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，

所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基：先按包括如下質(zhì)量百分比的各原料復配：谷糠60-70％，麩皮12-15％，豆餅3-5％，花生餅粉3-5％，玉米粉8-10％，碳酸鈣0.5％，硫酸銨0.5％，血胨0.1-0.2％，pH自然，保證各原料的百分總量為100％；然后加入水調(diào)整濕度為50-60％。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基在接種前還需要滅菌，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌條件為：于0.11-0.12MPa壓力下120攝氏度濕熱滅菌30min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，

所述活孢子的計數(shù)檢測方法為：采用雙層平板培養(yǎng)計數(shù)檢驗法，進行4個重復，取平均值。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，所述雙層平板培養(yǎng)計數(shù)檢驗法，具體包括：

1、培養(yǎng)基的準備：

固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，瓊脂2.0-2.2％，水100mL，pH6.5-7.0；

半固體培養(yǎng)基：牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.5％，瓊脂0.8-1.2％，水100mL；

將固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基分別裝入250mL三角瓶中，每瓶100mL，于0.11-0.12MPa壓力下115-120攝氏度滅菌30min，備用；

2、檢驗：

1)、取1g待檢樣品，用無菌水進行梯度稀釋后，取1mL梯度稀釋后的菌懸液加入到半固體培養(yǎng)基中，制得含菌半固體培養(yǎng)基；

2)、將固體培養(yǎng)基加熱至熔化后，倒入培養(yǎng)皿中，待固體培養(yǎng)基冷卻凝固后，向其中倒入含菌半固體培養(yǎng)基，放平靜置，待凝固后，于28-30攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)，然后記錄每個培養(yǎng)皿中單個活孢子菌落的個數(shù)；

每個孢子粉中活孢子個數(shù)＝單個活孢子菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種阿佛曼鏈霉菌活性孢子的固體發(fā)酵工藝，其特征在于，

所述梯度稀釋，采用4級梯度稀釋，每級稀釋100倍；具體操作如下：將1g待檢樣品加入100mL無菌水中，得到10^-2數(shù)量級的菌懸液，然后，取1mL10^-2數(shù)量級菌懸液加入到99mL無菌水中，得到10^-4數(shù)量級的菌懸液，然后取1mL10^-4數(shù)量級菌懸液加入到99mL無菌水中，得到10^-6數(shù)量級的菌懸液；1mL10^-6數(shù)量級菌懸液加入到99mL無菌水中，得到10^-8數(shù)量級的菌懸液，即可。