[發(fā)明專利]一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202111325046.7
• 申請日: 2021-11-10
• 公開（公告）號: CN114015716A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林春;劉正杰;張玉敏;毛自朝;林彤;何芳蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/53;A01H5/12;A01H6/02
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

本發(fā)明屬于基礎(chǔ)研究技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法，所述病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法包括：準備相關(guān)病毒的載體；進行目的基因和指示基因的克隆；進行VIGS重組載體的構(gòu)建；進行病毒誘導(dǎo)的基因沉默的實驗。本發(fā)明的病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法，利用煙草脆裂病毒(TRV，Tobravirus)介導(dǎo)進行藜麥基因功能驗證，涉及利用TRV(Tobravirus，煙草脆裂病毒)病毒載體，以藜麥PDS(phytoene desaturase，八氫番茄紅素脫氫酶)基因為標記基因，在藜麥中通過TRV病毒介導(dǎo)的VIGS體系進行基因的功能分析方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基礎(chǔ)研究技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法。

背景技術(shù)

目前，藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)屬于莧科藜屬一年生植物，籽粒具有極高的營養(yǎng)價值，其蛋白質(zhì)含量遠超其他糧食，富含多種人體必需氨基酸、且含量均衡，藜麥中還含有豐富的礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮、多酚、皂苷等活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、增強免疫等生理功效，進而能夠降低患一些疾病的風(fēng)險等生理功能。此外，籽粒不含麩質(zhì)，特別適合對麩質(zhì)過敏的人群，具有增強其免疫力的作用。

近年來，隨著人們對健康需求的提高，對藜麥產(chǎn)量的需求也大量增加。由于藜麥花序呈圓錐型，具有多級分枝，花序(穗)大而緊密，藜麥的花小，藜麥的花由不同大小的雌花及兩性花組成，比例受到遺傳和環(huán)境的影響。兩性花有4～8個花藥與萼片對生，1個上位子房，子房上柱頭有2或3個分枝，主要分布于主花枝和次級花枝的頂端；雌花有三種類型，按花被的存在與缺失分為具花被的大雌花、具花被的小雌花和無花被的小雌花。

由于藜麥花的結(jié)構(gòu)和著生部位的差異，且花結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致人工去雄難，致使藜麥雜交技術(shù)研究進展緩慢。在自然界中，藜麥常存在花粉敗育的現(xiàn)象，嚴重時出現(xiàn)整朵花的花藥完全敗育，常常導(dǎo)致藜麥籽粒出現(xiàn)空癟粒的現(xiàn)象，產(chǎn)量受到較大影響。因此，亟需一種新的藜麥基因功能的驗證方法。

通過上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺陷為：由于藜麥花的結(jié)構(gòu)和著生部位的差異，且花結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，導(dǎo)致人工去雄難，致使藜麥雜交技術(shù)研究進展緩慢。在自然界中，藜麥常存在花粉敗育的現(xiàn)象，嚴重時出現(xiàn)整朵花的花藥完全敗育，常常導(dǎo)致藜麥籽粒出現(xiàn)空癟粒的現(xiàn)象，產(chǎn)量受到較大影響。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法，尤其涉及一種通過病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced genesilencing，VIGS)進行藜麥基因功能驗證的方法。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法，所述病毒誘導(dǎo)的基因沉默介導(dǎo)的藜麥基因功能驗證的方法包括以下步驟：

步驟一，準備相關(guān)病毒的載體；

步驟二，進行目的基因和指示基因的克隆；

步驟三，進行VIGS的重組載體的構(gòu)建；

步驟四，進行病毒誘導(dǎo)的基因沉默的實驗。

進一步，步驟三中，所述VIGS的重組載體的構(gòu)建，包括：

指示基因，即PDS基因和目的基因擴增片段與病毒載體的連接，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI雙酶切，雙酶切后將酶切產(chǎn)物進行DNA純化，用T4DNA連接酶在16℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞；經(jīng)PCR鑒定后篩選陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切驗證，切出目的片段的載體質(zhì)粒及為指示基因-病毒連接的重組載體和病毒-目的基因連接的重組載體。

進一步，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：