[發明專利]一種病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法

在審

• 申請號: 202111325046.7
• 申請日: 2021-11-10
• 公開（公告）號: CN114015716A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 林春;劉正杰;張玉敏;毛自朝;林彤;何芳蕾
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N15/83
• 分類號: C12N15/83;C12N15/53;A01H5/12;A01H6/02
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.一種病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法包括以下步驟：

步驟一，準備相關病毒的載體；

步驟二，進行目的基因和指示基因的克?。?/p>

步驟三，進行VIGS的重組載體的構建；

步驟四，進行病毒誘導的基因沉默的實驗。

2.如權利要求1所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，步驟三中，所述VIGS的重組載體的構建，包括：

指示基因，即PDS基因和目的基因擴增片段與病毒載體的連接，采用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切，雙酶切后將酶切產物進行DNA純化，用T4DNA連接酶在16℃下連接過夜，轉化大腸桿菌感受態細胞；經PCR鑒定后篩選陽性克隆進行擴大培養，提取質粒進行酶切驗證，切出目的片段的載體質粒及為指示基因-病毒連接的重組載體和病毒-目的基因連接的重組載體。

3.如權利要求2所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，所述PDS基因和AMS基因的克隆，包括：

提取藜麥葉和花序的RNA，反轉合成cDNA第一鏈；根據NCBI中公布的玉米PDS基因序列XM_021864666.1和預測的藜麥AMS基因序列，選擇PDS和AMS的VIGS干擾靶標片段長度分別為461bp和498bp；以藜麥葉片的cDNA第一鏈為板，PCR擴增CqPDS基因片段，分別在上下游引入BamHI和EcoRI酶切位點和保護堿基；用1％瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行分析，根據PCR產物純化試劑盒說明回收目的片段，將其與pGEM-T Easy載體連接，測序驗證后再分別插入載體pTRV2中，獲得重組VIGS載體pTRV2-CqPDS和pTRV2-CqAMS，測序驗證正確后備用。

4.如權利要求3所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，所述擴增PDS引物Cq_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述擴增AMS引物Cq_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述檢測PDS引物RT_PDS的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述檢測AMS引物RT_AMS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述內參基因引物Cq_ACT1的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.如權利要求2所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，所述VIGS的載體構建，包括：

PDS基因和AMS基因擴增片段于pTRV2載體同時采用限制性內切酶BamHI和EcoRI雙酶切，雙酶切后將酶切產物進行DNA純化，用T4 DNA連接酶在16℃下連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；經PCR鑒定后篩選陽性克隆進行擴大培養，提取質粒進行酶切驗證，切出目的片段的載體質粒及為重組載體pTRV2-CqPDS和pTRV2-CqAMS。

6.如權利要求1所述病毒誘導的基因沉默介導的藜麥基因功能驗證的方法，其特征在于，步驟四中，所述病毒誘導的基因沉默的實驗，包括：

(1)病毒及其重組載體的農桿菌侵染液的制備；

(2)藜麥材料的準備及注射侵染；

(3)qRT-PCR檢測目的基因是否沉默。