[發明專利]一種ctDNA超高測序深度下低豐度突變的檢測系統和方法

有效

• 申請號: 202111314976.2
• 申請日: 2021-11-08
• 公開（公告）號: CN114093428B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 邵陽;吳雪;常志力;包華;劉睿;徐秀秀;劉思思;汪笑男
• 申請（專利權）人: 南京世和基因生物技術股份有限公司;南京世和醫療器械有限公司
• 主分類號: G16B40/20
• 分類號: G16B40/20;G16B20/50
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產權代理有限公司 32424
• 代理人: 鄧唯

本發明公開一種NGS雙端分子標簽測序技術和背景降噪算法的檢測血漿ctDNA超高測序深度下低豐度突變的檢測方法，包括：(1)對所有測序讀段攜帶的雙端分子標簽序列收集并標注分子標簽序列和組合方式；(2)標注后的讀段與參考序列進行比對，將分子標簽組合序列和比對位置相同的測序讀段歸類至單分子共識序列；(3)將存在的分子標簽組互補且讀段序列互補的單分子共識序列進一步歸類至雙鏈共識序列；(4)對包含單鏈共識序列和雙鏈共識序列的比對結果進行突變檢測，注釋和過濾；(5)對突變檢測結果，利用健康人檢測結果使用零膨脹泊松分布算法進行背景降噪。在保證100％特異性的前提下提升了檢測靈敏度的，ctDNA中豐度0.1％突變的檢測敏感性達到95％以上。

技術領域

本發明涉及一種ctDNA超高深度測序深度下低豐度突變的檢測系統和方法，具體地，本發明涉及對測序讀段進行聚類的方法和利用健康人群檢測結果進行背景降噪。

背景技術

循環腫瘤DNA(circulating?tumor?DNA,ctDNA)來源于凋亡、壞死的腫瘤細胞或腫瘤細胞分泌釋放產生的小片段DNA，是人體循環游離DNA(circulating?cell-free?DNA,cfDNA)的一部分。

CN113373524A專利披露了一種ctDNA測序方法以及該方法中涉及的標簽接頭，從而提高檢測靈敏度和特異性，實現提升檢出率的同時提高對假陽性突變的分辨率，結合分子標簽技術、樣本標簽多樣化技術及超高深度測序對ctDNA進行檢測，可以有效提高測序靈敏度。但是，由于在超高深度測序的過程中，分子標簽僅修正了在測序過程中產生的隨機誤差，對于背景基線噪音，如基因組上部分特定轉座子或區域受建庫試劑，DNA損傷修復等混合因素影響發生的堿基偏好性突變(GT)，仍然無法消除，所以對檢測準確性仍然產生影響；并且在對于檢測數據與基線樣本進行比對時，由于在對照樣本中絕大多數健康人在同一位點上的突變豐度為0的頻率較高，數據的分布與標準泊松分布有較大偏差，導致了對比時存在一定的誤差。

發明內容

本發明所要實際解決的技術問題是：在對cfDNA進行超高深度的測序時，由于基線樣本數據存在的噪音、基線樣本中較多的位點存在突變豐度為0導致的不符合標準泊松分布，使得數據比對后存在著檢測數據存在誤差。

本發明提出了一種基于雙端分子標簽ctDNA超高深度測序下，通過歸類具有相同分子標簽組合序列和健康人群結果背景降噪的方法，從而提高檢測靈敏度和特異性，實現提升檢出率的同時提高對假陽性突變的分辨率，最終提高檢測的敏感性和準確性。對突變檢測結果，利用健康人檢測結果使用零膨脹泊松分布算法進行背景降噪。在保證100％特異性的前提下提升了檢測靈敏度的，ctDNA中豐度0.1％突變的檢測敏感性達到95％以上。

技術方案是：

一種ctDNA超高測序深度下低豐度突變的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，對待測樣本進行高通量測序并獲得下機數據；

步驟2，對下機數據中的讀段數據進行校驗后，計算出各個突變的豐度；

步驟3，獲得對照樣本中各個位點上存在的突變，并在對對照樣本數據集中每個位點的是否發生突變的情況進行零膨脹矯正后，計算出每個位點上的零膨脹矯正后預期平均突變豐度；

步驟4，將待測樣本的突變豐度與零膨脹矯正后預期平均突變豐度進行比較，進行差異顯著性判定。

所述的步驟3中，還包括：獲得對照樣本上的各個位點的突變人數發生百分比；并且，在步驟4中，若突變人數發生百分比小于設定閾值時，將待測樣本的突變豐度與零膨脹矯正后預期平均突變豐度進行單側檢驗對比，若大于設定閾值時，進行累計分布頻數檢驗。

所述的設定閾值是1-10％。