[發(fā)明專利]單個(gè)抗原特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111306352.6
• 申請(qǐng)日: 2021-11-05
• 公開（公告）號(hào): CN114134163A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王戰(zhàn)輝;沈建忠;溫凱;余文博;于雪芝;江海洋;李園;李培培
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/85;C12N5/20;C07K16/00
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發(fā)明公開了單個(gè)抗原特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞篩選方法，通過制備表達(dá)EGF?R?AVI?tag融合蛋白的轉(zhuǎn)基因Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，結(jié)合傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的脾細(xì)胞融合技術(shù)，獲得可在細(xì)胞膜展示分泌型特異性抗體的轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞，并利用單細(xì)胞分選系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞的篩選。本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，提供一種精準(zhǔn)、高通量的轉(zhuǎn)基因雜交瘤單克隆抗體生產(chǎn)平臺(tái)。與傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)相比，顯著縮短了單個(gè)抗原特異性雜交瘤細(xì)胞的制備時(shí)間和成本，提高了單細(xì)胞率和陽性率，且制備的單克隆抗體的效價(jià)和親和力也顯著提高。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因雜交瘤抗體制備技術(shù)可用于制備高特異性、高靈敏度和高穩(wěn)定性稀有單克隆抗體，應(yīng)用前景廣闊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及單個(gè)抗原特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞篩選方法。

背景技術(shù)

單克隆抗體(Monoclonal antibody,mAb)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測和食品科學(xué)等領(lǐng)域。近年來，噬菌體展示技術(shù)和單個(gè)B細(xì)胞技術(shù)為單克隆抗體的發(fā)展提供了廣闊的空間，但這些方法仍處于初級(jí)階段，對(duì)于抗體的廣泛制備還具有一定的局限性。因此，傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)仍然是目前制備單克隆抗體最主要的方法。在傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)中，有限稀釋法篩選抗原特異性的雜交瘤細(xì)胞耗時(shí)、耗力且效率低，同時(shí)在雜交瘤細(xì)胞早期，抗體分泌量極低，很難實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的檢測。因此抗原特異性雜交瘤細(xì)胞的高效篩選選尤為重要。

近年來，基于膜受體的流式細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)廣泛應(yīng)用于抗原特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選。由于雜交瘤細(xì)胞表面缺少抗原結(jié)合受體，導(dǎo)致篩選過程中較高假陽性的出現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞表面抗體的展示，從而提高抗原特異性雜交瘤細(xì)胞篩選的精準(zhǔn)度，降低假陽性。通過化學(xué)共價(jià)修飾法，在雜交瘤細(xì)胞膜表面偶聯(lián)脂肪鏈(Oleyl-PEG4000-NHS)，實(shí)現(xiàn)了雜交瘤細(xì)胞表面抗體的展示，顯著提高了抗原特異性雜交瘤細(xì)胞的篩選效率。但細(xì)胞表面偶聯(lián)的脂肪鏈很不穩(wěn)定，會(huì)隨著雜交瘤細(xì)胞分裂而丟失，且化學(xué)共價(jià)修飾對(duì)雜交瘤細(xì)胞的正常功能和活力也會(huì)造成不可逆的損傷。表皮細(xì)胞生長因子受體(EGF-R)是一個(gè)跨膜糖蛋白，通過融合表達(dá)技術(shù)，其跨膜區(qū)蛋白廣泛應(yīng)用于細(xì)胞膜表面外源蛋白的展示。

抗原特異性抗體展示在轉(zhuǎn)基因雜交瘤表面，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體結(jié)合性能和表達(dá)水平的快速鑒定和準(zhǔn)確分析，從而完成對(duì)分泌能力強(qiáng)且抗體親和力較高的轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)鑒定。

因此開發(fā)一種高通量、自動(dòng)化和精確的單個(gè)抗原特異性雜交瘤細(xì)胞篩選及抗體制備技術(shù)尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供單個(gè)抗原特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞篩選方法。

本發(fā)明構(gòu)思如下：本發(fā)明基于PiggyBac轉(zhuǎn)座酶將EGF-R的跨膜區(qū)與生物素受體肽AVI-tag穩(wěn)定整合到雜交瘤細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)EGF-R-AVI-tag融合蛋白在轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)，通過生物素連接酶偶聯(lián)鏈霉素修飾的抗原，實(shí)現(xiàn)分泌型抗體的捕獲，從而達(dá)到抗原特異性抗體在雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞表面的展示，為抗原特異性雜交瘤細(xì)胞的高效精準(zhǔn)篩選奠定基礎(chǔ)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，第一方面，本發(fā)明提供單個(gè)抗原特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞篩選方法，所述方法包括：制備表達(dá)EGF-R-AVI-tag融合蛋白的轉(zhuǎn)基因Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，結(jié)合傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的脾細(xì)胞融合技術(shù)，獲得可在細(xì)胞膜展示分泌型特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，并利用單細(xì)胞分選系統(tǒng)(如CellenONE全自動(dòng)單細(xì)胞分選系統(tǒng))實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)特異性轉(zhuǎn)基因雜交瘤細(xì)胞的篩選。

所述EGF-R-AVI-tag融合蛋白為：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)SEQ ID NO:1所示序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

前述的方法，編碼EGF-R-AVI-tag融合蛋白的核酸序列通過質(zhì)粒導(dǎo)入Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，或通過基因工程手段整合到Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞的基因組中。