[發(fā)明專利]一種核酸代謝酶活性檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111296052.4
• 申請(qǐng)日: 2021-11-03
• 公開（公告）號(hào): CN114250281A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周蓉;王攀
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳銘毅智造科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12Q1/48
• 代理公司: 深圳市科冠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44355
• 代理人: 王久明

本發(fā)明涉及一種核酸代謝酶活性檢測(cè)方法，其步驟如下：S1，人工合成一條單鏈核酸片段和一段從3′端互補(bǔ)的引物，通過退火反應(yīng)形成模板；S2，將模板、反應(yīng)緩沖液、熒光修飾的核苷酸衍生物或熒光修飾的核苷酸衍生物類似物、待測(cè)定的核酸代謝酶進(jìn)行反應(yīng)并純化得到初次純化產(chǎn)物；S3，將初次純化產(chǎn)物、Taq反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)并純化得到二次純化產(chǎn)物；S4，對(duì)二次純化產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀分析；S5，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將S4中結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測(cè)結(jié)果。該發(fā)明操作快捷，活性檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種核酸代謝酶活性檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

核酸代謝，包括DNA和RNA合成和降解，是所有核酸研究和相關(guān)生命科學(xué)領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)。參與DNA復(fù)制和修復(fù)的核酸代謝酶的標(biāo)準(zhǔn)活性檢測(cè)方法是通過檢測(cè)測(cè)量DNA或RNA的產(chǎn)物合成或降解放射性或熒光標(biāo)記的核酸底物。例如，用同位素標(biāo)記的方法，結(jié)合DNA的熒光染料法(PicoGreen或EvaGreen)均廣泛應(yīng)用于DNA定量，進(jìn)而應(yīng)用于核酸代謝酶的活性檢測(cè)方法中，測(cè)定核酸代謝酶的合成活性或者降解活性。為了更好地研究反應(yīng)中間體或副產(chǎn)物，更全面的捕獲反應(yīng)途徑的具體步驟和細(xì)節(jié)，全面了解核酸酶的活性，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)被廣泛的應(yīng)用于分析底物，中間體的大小分布等實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)核酸酶進(jìn)行進(jìn)一步的表征和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，但聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析方法相對(duì)于前述的放射性或熒光標(biāo)記法，存在著實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)效率低通量小等缺點(diǎn)，限制了核酸酶分析的范圍。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有的不足，本發(fā)明提供一種核酸代謝酶活性檢測(cè)方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種核酸代謝酶活性檢測(cè)方法，其特征在于:其步驟如下：

S1，人工合成一條單鏈核酸片段和一段從3′端互補(bǔ)的引物，通過退火反應(yīng)形成核酸引物復(fù)合物，稱之為模板；

S2，將模板、反應(yīng)緩沖液、熒光修飾的核苷酸衍生物或熒光修飾的核苷酸衍生物類似物、待測(cè)定的核酸代謝酶加入同一個(gè)PCR管中，在PCR反應(yīng)儀中反應(yīng)得到初始產(chǎn)物，并對(duì)初始產(chǎn)物進(jìn)行kit純化得到初次純化產(chǎn)物；

S3，將初次純化產(chǎn)物、Taq反應(yīng)緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶加入另一個(gè)PCR管中，在PCR反應(yīng)儀中反應(yīng)得到二次反應(yīng)產(chǎn)物，并對(duì)二次反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行kit純化得到二次純化產(chǎn)物；

S4，對(duì)二次純化產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳儀分析，收集分離圖譜并計(jì)算出單位時(shí)間內(nèi)堿基的延伸效率；

S5，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將S4中并分析計(jì)算延伸效率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測(cè)定核酸代謝酶的活性；其中步驟S2和S3中的PCR反應(yīng)條件是溫度為10℃—90℃，時(shí)間為10s—60min。

作為優(yōu)選，所述模板為一條單鏈核酸片段，其片段長(zhǎng)度為50-150個(gè)bp。

作為優(yōu)選，所述引物長(zhǎng)度為15-25個(gè)bp。

作為優(yōu)選，所述步驟S2的反應(yīng)條件是溫度為45-65℃，時(shí)間為1min。

作為優(yōu)選，所述步驟S3的反應(yīng)條件是溫度為72℃，時(shí)間為20min。

作為優(yōu)選，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法為，在步驟S2中將待測(cè)定的核酸代謝酶改為按照活性梯度稀釋成不同濃度的已知活性的核酸代謝酶，然后依次經(jīng)過S2、S3、S4步驟得出各種梯度單位活性初始斜率，并制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

作為優(yōu)選，所述步驟S2中，待測(cè)定的核酸代謝酶按照濃度梯度稀釋成不同濃度的核酸代謝酶，然后每一個(gè)濃度的核酸代謝酶均依次經(jīng)過S2、S3、S4步驟得出各濃度單位活性初始斜率，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得出相對(duì)活性單位。

作為優(yōu)選，所述毛細(xì)管電泳儀分析依據(jù)熒光染料的種類、分離圖譜的峰型大小來計(jì)算的。