[發明專利]一種核酸代謝酶活性檢測方法

在審

• 申請號: 202111296052.4
• 申請日: 2021-11-03
• 公開（公告）號: CN114250281A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 周蓉;王攀
• 申請（專利權）人: 深圳銘毅智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/48
• 代理公司: 深圳市科冠知識產權代理有限公司 44355
• 代理人: 王久明

1.一種核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:其步驟如下：

S1，人工合成一條單鏈核酸片段和一段從3′端互補的引物，通過退火反應形成核酸引物復合物，稱之為模板；

S2，將模板、反應緩沖液、熒光修飾的核苷酸衍生物或熒光修飾的核苷酸衍生物類似物、待測定的核酸代謝酶加入同一個PCR管中，在PCR反應儀中反應得到初始產物，并對初始產物進行kit純化得到初次純化產物；

S3，將初次純化產物、Taq反應緩沖液、dNTP、Taq DNA聚合酶加入另一個PCR管中，在PCR反應儀中反應得到二次反應產物，并對二次反應產物進行kit純化得到二次純化產物；

S4，對二次純化產物用毛細管電泳儀分析，收集分離圖譜并計算出單位時間內堿基的延伸效率；

S5，制作標準曲線，將S4中并分析計算延伸效率代入標準曲線得出待測定核酸代謝酶的活性；其中步驟S2和S3中的PCR反應條件是溫度為10℃—90℃，時間為10s—60min。

2.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述模板為一條單鏈核酸片段，其片段長度為50-150個bp。

3.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述引物長度為15-25個bp。

4.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述步驟S2的反應條件是溫度為45-65℃，時間為1min。

5.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述步驟S3的反應條件是溫度為72℃，時間為20min。

6.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述標準曲線的制備方法為，在步驟S2中將待測定的核酸代謝酶改為按照活性梯度稀釋成不同濃度的已知活性的核酸代謝酶，然后依次經過S2、S3、S4步驟得出各種梯度單位活性初始斜率，并制出標準曲線。

7.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述步驟S2中，待測定的核酸代謝酶按照濃度梯度稀釋成不同濃度的核酸代謝酶，然后每一個濃度的核酸代謝酶均依次經過S2、S3、S4步驟得出各濃度單位活性初始斜率，并代入標準曲線中，得出相對活性單位。

8.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法,其特征在于:所述毛細管電泳儀分析依據熒光染料的種類、分離圖譜的峰型大小來計算的。

9.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法,其特征在于:所述核酸代謝酶包括高通量的核酸代謝酶。

10.根據權利要求1所述核酸代謝酶活性檢測方法，其特征在于:所述熒光修飾的核苷酸衍生物和熒光修飾的核苷酸衍生物類似物是在3′羥基處保護基團修飾且堿基上攜帶熒光標識基團的核苷酸衍生物。