[發明專利]一種高產D-泛酸的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202111295464.6
• 申請日: 2021-11-03
• 公開（公告）號: CN114181875B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 柳志強;王培;周海巖;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種高產D-泛酸的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是以E.coliW3110Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG^a/ΔavtA/ilvE^b/coaA^cΔilvATrc-lpdΔglk為出發菌株，回補ilvA基因，將ilvE的起始密碼子GTG突變成TTG，再分別將serA、glyA、ilvB、ilvN、pntA、pntB、cyo基因的啟動子替換為Trc啟動子，最后過表達來源于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032的基因panB和基因panC構建而成；a表示ilvG基因的976-979堿基突變成ATC；b表示ilvE基因的起始密碼子ATG突變成GTG；c表示coaA基因的316-318位堿CGT基突變成GCT。

2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述ilvA基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述ilvE基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述serA基因核苷酸序列如SEQID NO.3所示；所述glyA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ilvB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ilvN基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述pntA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述pntB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述cyo基因基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述panB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述panC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。所述Trc啟動子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌按如下方法構建：

(1)回補ilvA基因：以出發菌株E.coli W3110 Trc-panCpanEpanBilvC/ilvG^a/ΔavtA/ilvE^b/coaA^cΔilvATrc-lpdΔglk)為模板，分別以L-ilvA-F/L-ilvA-R和R-ilvA-F/R-ilvA-R為引物，擴增基因供體donor DNA；以E.coli W3110的基因組為模板，以T-ilvA-F和T-ilvA-R引物擴增得到ilvA片段；以pTarget質粒為模板，以pTarget-ilvA-F和pTarget-ilvA-R為引物擴增質粒并線性化處理得到線性化pTarget-ilvA質粒；將donor DNA、ilvA片段和線性化pTarget-ilvA質粒連接后轉化出發菌株電轉感受態細胞，消除pTarget和pCas9質粒，構建菌株DPA11(ilvA^*)，記為菌株DPA12；所述出發菌株記為菌株DPA11；

(2)ilvE的起始密碼子突變：以pTarget質粒為模板，以pTarget-ilvE-F和pTarget-ilvE-R為引物擴增質粒并線性化處理得到線性化質粒pTarget-ilvE；以出發菌株基因組為模板，以引入突變的起始密碼子TGG的L-ilvE-F/L-ilvE-R和R-ilvE-F/R-ilvE-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-ilvE與上下游donor DNA連接，利用引物T-ilvE-F/T-ilvE-R測序成功后轉化菌株DPA12電轉感受態細胞，消除pTarget和pCas9質粒，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^**)，記為菌株DPA13；

(3)serA啟動子替換：以pTarget作為模板，以pTarget-serA-F和pTarget-serA-R為引物擴增質粒并線性化處理，獲得線性化質粒pTarget-serA；以出發菌株基因組為模板，以L-serA-F/L-serA-R和R-serA-F/R-serA-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-serA與上下游donor DNA連接，通過引物T-serA-F/T-serA-R測序成功后轉化菌株DPA13電轉感受態細胞并消除質粒pTarget和pCas9，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^**Trc-serA)，記為菌株DPA14；

(4)glyA啟動子替換：以pTarget作為模板，以pTarget-glyA-F和pTarget-glyA-R為引物擴增質粒并進行線性化處理獲得線性化質粒pTarget-glyA；以出發菌株基因組為模板，以L-glyA-F/L-glyA-R和R-glyA-F/R-glyA-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-glyA和上下游donor DNA連接，通過引物T-glyA-F/T-glyA-R測序成功后轉化菌株DPA14電轉感受態細胞并消除質粒pTarget和pCas9，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^**Trc-serATrc-glyA)，記為菌株DPA15；

(5)ilvB、ilvN的啟動子替換：以pTarget作為模板，以pTarget-ilvBN-F和pTarget-ilvBN-R為引物擴增質粒并進行線性化處理獲得線性化質粒pTarget-ilvBN；以出發菌株基因組為模板，以L-ilvBN-F/L-ilvBN-R和R-ilvBN-F/R-ilvBN-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-ilvBN和上下游donor DNA連接，通過引物T-glyA-F/T-glyA-R測序成功后轉化菌株DPA15電轉感受態細胞并消除質粒pTarget和pCas9，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^**Trc-serATrc-glyATrc-ilvBN)，記為菌株DPA16；

(6)pntA、pntB的啟動子替換：以pTarget作為模板，以pTarget-pntAB-F和pTarget-pntAB-R為引物擴增質粒并進行線性化處理獲得線性化質粒pTarget-pntAB；以出發菌株基因組為模板，以L-pntAB-F/L-pntAB-R和R-pntAB-F/R-pntAB-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-pntAB與上下游donor DNA連接，通過引物T-pntAB-F/T-pntAB-R測序成功后轉化菌株DPA16電轉感受態細胞并消除質粒pTarget和pCas9，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^*Trc-serATrc-glyATrc-ilvBNTrc-pntAB)，記為菌株DPA17；

(7)cyo啟動子的替換：以pTarget作為模板，以pTarget-cyo-F和pTarget-cyo-R為引物擴增并進行線性化處理獲得線性化質粒pTarget-cyo；以出發菌株基因組為模板，以L-cyo-F/L-cyo-R和R-cyo-F/R-cyo-R為引物擴增得到上下游donor DNA；將線性化質粒pTarget-cyo與上下游donor DNA連接，通過引物T-cyo-F/T-cyo-R測序成功后轉化菌株DPA17電轉感受態細胞并消除質粒pTarget和pCas9，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^*Trc-serATrc-glyATrc-ilvBNTrc-pntABTrc-cyo)，記為菌株DPA18；

(8)過表達來源于谷氨酸棒狀桿菌的panB和panC：以質粒pTrc99a為模板，以pTrc99a-line-F/pTrc99a-line-R為引物進行PCR擴增，PCR產物經過Dpn I在37℃保溫消化2h，去除其中的甲基化載體，獲得線性化pTrc99a質粒；以谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032的基因組為模板，以引物panB-F/panB-R和panC-F/panC-R，分別PCR擴增panB和panC片段；將線性化pTrc99a質粒、片段panB和panC連接轉化E.coliDH5α感受態，提取質粒pBC；將pBC質粒轉化到菌株DPA18中，構建菌株DPA11(ilvA^*ilvE^*Trc-serATrc-glyATrc-ilvBNTrc-pntABTrc-cyo)/pBC，即為所述的高產D-泛酸的基因工程菌，記為菌株DPA19。