[發明專利]一種高產D-泛酸的基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 202111295464.6
• 申請日: 2021-11-03
• 公開（公告）號: CN114181875B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 柳志強;王培;周海巖;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/52;C12N15/54;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開一種高產D?泛酸的基因工程菌及其應用，本發明通過回補底盤菌DPA11已經敲除的ilvA基因，利用起始密碼子TTG替換ilvE的起始密碼子GTG，利用Trc啟動子替換serA、glyA、ilvB、ilvN、pntA、pntB和cyo的原始啟動子，再在質粒上異源過表達來源于谷氨酸棒狀桿菌的panB和panC，得到D?泛酸高產的大腸桿菌基因工程菌株，該菌株在搖瓶水平上D?泛酸的產量達到了6.81g/L，是原始出發菌株的3.83倍，并且避免了外源添加異亮氨酸，節約成本，同時發酵罐放大培養節約大量的時間成本。

(一)技術領域

本發明涉及一種高產D-泛酸的基因工程菌及其構建方法，以及該工程菌在微生物發酵制備D-泛酸中的應用。

(二)背景技術

D-泛酸又可稱之為維生素B5，是一種重要的水溶性維生素，在生物體內起著重要的生理作用，是輔酶A和酰基載體蛋白(ACP)的重要合成前體。D-泛酸及其衍生物在食品、醫藥、飼料、化妝品等領域有廣泛的應用。在食品領域，D-泛酸可作為一種食品營養強化劑可用于多種食品添加以補充營養成分；在醫藥方面，D-泛酸作為人體必需的維生素普遍存在于生物體內，其衍生物D-泛酸鈣的單方制劑可用于治療D-泛酸缺乏癥，與其他組分構成的復方制劑可用于治療神經炎、神經衰弱、術后腸絞痛和呼吸道等疾病，同時也可用于多種保健食品等；在飼料方面，飼料中添加一定劑量的D-泛酸能滿足豬、雞和魚類等生長發育、脂肪代謝的需求，避免出現生長遲緩、適應性及抗病性下降、生殖系統障礙、毛發脫落的現象；在化妝品方面，D-泛酸及其衍生物D-泛醇與皮膚、毛發的營養狀態息息相關，可用于防治毛發干枯和損傷，提高毛發營養使其光線亮澤。并且有增加保濕和抗老化的作用，促進皮膚對營養成分的吸收，廣泛應用與保濕霜、護發液和乳液等化妝品。

目前生產D-泛酸的方法主要有三種：化學合成法，酶催化法和發酵合成法。化學合成法，先通過化學法制備得到前體物β-丙氨酸和D,L-泛解酸內酯，再合成D-泛酸。其中的β-丙氨酸主要通過丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酸亞胺法合成得到，而D,L-泛解酸內酯主要通過異丁醛-甲醛法、異丁醛-醛乙酸法和異丁醛-三氯甲烷法制備得到，但是法學法高耗能、對設備損耗大，同時產生對人體和環境的有害物質。得到上述中間體后，其中β-丙氨酸用氫氧化鈣處理形成β-丙氨酸鈣，β-丙氨酸鈣再跟D,L-泛解酸內酯在甲醇溶液和高溫下發生酰化反應得到D，L-泛酸鈣，在通過物理拆分得到高純度的D-泛酸鈣。另一種拆分方法是先對D,L-泛解酸內酯拆分，D,L-泛解酸內酯的拆分方法又包含化學拆分法和酶法拆分，其中化學拆分主要采用奎寧、麻黃素、L-亮氨酸、L-1-對硝基甲苯-2-氨基-1,3-丙二醇等拆分試劑對D,L-泛解酸內酯拆分。酶法拆分主要使用L-泛解酸內酯水解酶、D-泛解酸內酯水解酶、酮泛解酸還原酶和醇脫氫酶等對D,L-泛解酸內酯進行拆分。得到的D-泛解酸內酯后，在將其跟β-丙氨酸鈣在甲醇溶液和高溫條件下進行酰化反應得到D-泛酸鈣。酶法合成D-泛酸，利用微生物來源的泛酸合成酶，以D-泛解酸和β-丙氨酸為底物完成D-泛酸的合成，但是其前體物D-泛解酸和β-丙氨酸仍需要化學合成得到。

隨著對微生物代謝過程的不斷了解和代謝工程技術的日益發展，使用葡萄糖作為廉價的原料來生產D-泛酸在內的高附加值產品具有廣闊的應用前景。但是，由于野生型菌株的自身原因，細胞內合成D-泛酸的途徑受限，所以發酵法生產D-泛酸最重要的是得到適當的D-泛酸高產菌株。在代謝改造過程中，由于不同的代謝途徑之間存在非線性的關系，以及輔因子的與中心代謝途徑的競爭和協作關系，需要從多個維度改造目的代謝途徑。