[發明專利]一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法

在審

• 申請號: 202111290686.9
• 申請日: 2021-11-02
• 公開（公告）號: CN113999920A
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發明（設計）人: 張煒;厲從志;王卓昊;鄭祥寬
• 申請（專利權）人: 南京悅聯生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12R1/19
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本發明公開了一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法，包括用于特異性擴增的3種血清型的禽致病性大腸桿菌基因序列的引物對組合，其中，所述的3種血清型的APEC菌株分別為EC164、EC165、EC168，所述用于特異性擴增O2型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于特異性擴增O78型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；用于特異性擴增O145型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。該禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法具有特異性好、快速簡便、成本低廉的優勢，可以快速檢測優勢流行血清型，掌握流行病學特征，為疾病防控提供依據。

技術領域

本發明涉及獸醫傳染病檢測技術領域，具體為一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法。

背景技術

禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）為革蘭氏陰性菌，是腸外致病性大腸桿菌中的一種，在雞和鴨、鵝等水禽中均有廣泛的流行，感染后的病禽通常伴有全身性病變和特征性病變如心包炎、肝周炎、氣囊炎等，甚至引起急性敗血癥而死亡。通常情況下幼禽對該病易感，多因急性敗血癥死亡，日齡較大的雞具有一定的抵抗力，而成年產蛋雞的大腸桿菌性敗血性腹膜炎則可引起較高的的死亡率，且APEC還可以穿透蛋殼引起雞胚感染，造成死胚、孵化率下降和弱雛率增加，給養禽業造成嚴重的經濟損失。

禽致病性大腸桿菌血清型眾多，同時，抗生素濫用亂用導致APEC耐藥情況日趨嚴重，不易控制，而且由于防控過程中抗生素的大量使用導致禽產品存在藥物殘留，嚴重影響人體健康。

市場上一般通過對病原菌的檢測來及時發現禽類的感染，目前對病原細菌的檢測，主要依靠常規的細菌學培養方法，耗時長，操作繁瑣，費時耗力，而PCR技術因其特異性強、敏感性高、操作簡單快速而得到廣泛應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法，以解決上述背景技術提出的目前市場上對于病原細菌檢測中存在的耗時長、操作繁瑣、費時耗力等難題。

為此，本發明提供如下技術方案：一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒及鑒定方法，包括用于特異性擴增的3種血清型的禽致病性大腸桿菌基因序列的引物對組合，其中，所述的3種血清型的APEC菌株分別為EC164、EC165、EC168。

進一步優化本技術方案，所述用于特異性擴增O2型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；

用于特異性擴增O78型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；

用于特異性擴增O145型莢膜基因的引物對分別具有SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。

進一步優化本技術方案，所述PCR試劑盒包括2×RapidTaqMasterMix（withddH2O）。

進一步優化本技術方案，所述PCR試劑盒包括3種血清型的陽性對照樣本。

進一步優化本技術方案，所述3種禽致病性大腸桿菌為EC164滅活菌液（O78陽性對照）、EC165（O2陽性對照）、EC168（O145陽性對照）。

一種禽致病性大腸桿菌三重PCR鑒定試劑盒的鑒定方法，該鑒定方法包括以下步驟：

S1：獲取待檢測菌株的純培養物，得到菌液；

S2：利用權力要求2、3中所述的PCR試劑盒，對步驟S1中的菌液純培養物進行多重PCR；

S3：對步驟S2的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶大小確定待檢測APEC的血清型。