[發明專利]一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標記選擇方法

在審

• 申請號: 202111286763.3
• 申請日: 2021-11-02
• 公開（公告）號: CN115011698A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 丁強;王慧利;夏淑雯;陳坤琳;趙芳;曹少先;錢勇;仲躋峰
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/683
• 代理公司: 常州市夏成專利事務所(普通合伙) 32233
• 代理人: 王敏

本發明公開了一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標記選擇方法，包括(1)針對荷斯坦奶牛miRNA前體區域設計特異性引物，對待檢奶牛基因組DNA進行PCR擴增，得到擴增產物；(2)利用BspE I限制性內切酶對PCR產物進行酶切，電泳分型，出現3種基因型：TT型、TC型、CC型；(3)CC型在精子活力顯著高于TT型，CC型精子畸形率顯著低于TT型，因此選擇CC型、TC型留種，提高C基因型頻率。該方法可提高奶牛精液品質選擇的準確性，用于高品質奶牛的選育工作，為加強中國荷斯坦奶牛優良種質提供選育工具。

技術領域

本發明涉及一種荷斯坦奶牛精子活力選擇方法，具體為一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標記選擇方法，屬于分子生物學應用領域。

背景技術

miRNA是一類長度在18～24個核苷酸的非編碼小分子RNA。它是由一段具有發夾環結構的長度為70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)剪切后生成。研究發現，miRNA前體在各個物種間具有高度的進化保守性，其莖部保守性強，變異幾率非常低，但環部保守性相對較弱。它主要通過與靶標基因3’-UTR(非翻譯區)的不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控個體發育、細胞凋亡、增殖及分化等生命活動，是基因表達調控的重要因子。

miRNA在生物體的不同組織細胞中、組織發育的不同階段存在不同的miRNA 表達類型和差異表達量。表明miRNA對基因的表達調控復雜多樣，此外，miRNA 自身的轉錄調控機制也很復雜。miRNA的序列變異對miRNA的生物學合成和功能具有重要影響。研究發現，莖環結構的miRNA前體序列在各個物種間具有高度的保守性，尤其莖部的保守性最強，而環部的保守性相對較弱。miRNA的SNPs 存在于初級miRNA序列、miRNA前體序列及成熟miRNA序列內部。這些SNPs不僅能夠影響miRNA的加工過程，還調控miRNA與其靶基因的互作，并進一步影響靶基因表達調控，改變miRNA的生物學功能。

荷斯坦奶牛是目前世界范圍內應用最為廣泛的奶牛品種，精液品質的優劣是衡量種公牛繁殖力的重要指標，也是種公牛選育中的最基本的衡量指標。精液品質衡量指標包括射精量、精子密度、精子活力、精子形態(畸形率)、精子DNA完整性等指標。精液品質性狀受到多種因素的影響，屬于復雜的數量性狀，具有一定的遺傳力，但是遺傳力較低，并且不同品種之間的遺傳力差異較大(0.04-0.6)。由于傳統的表型選擇準確性低，且表型值需要在公牛性成熟采精后才能逐步表現出來，周期很長，無法進行超早期選擇，遺傳進展緩慢。

發明內容

本發明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種荷斯坦奶牛精子活力 miRNA分子標記選擇方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的，一種荷斯坦奶牛精子活力 miRNA分子標記選擇方法，包括以下步驟，

1)選取56頭荷斯坦奶牛，人工采精各1.5ml，測定精液品質數據，并采用常規酚、氯仿法提取精子DNA，電泳及測定OD260/280法檢測DNA質量；

2)根據GenBank序列NC_037350.1，利用Primer Premier 6設計一對特異性引物，PCR擴增荷斯坦奶牛miR-6531前體區域序列，PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色檢測擴增結果；

3)荷斯坦奶牛miR-6531前體區域73位點存在一個T→C突變，產生一個 BspE I酶切位點，利用BspE I限制性內切酶，對所述的擴增產物進行酶切，采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像系統拍照，將獲得427bp片段的定義為TT型，獲得427bp、250bp、177bp三個片段的定義為TC型，獲得250bp、177bp兩個片段的定義為CC型；

4)采用單因素方差分析比較不同基因型間各精液品質指標的差異，結果表明CC型奶牛個體的精液品質顯著高于TT型，選擇CC型和TC型個體留種。