[發(fā)明專(zhuān)利]一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111286763.3
• 申請(qǐng)日: 2021-11-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115011698A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁強(qiáng);王慧利;夏淑雯;陳坤琳;趙芳;曹少先;錢(qián)勇;仲躋峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/683
• 代理公司: 常州市夏成專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 32233
• 代理人: 王敏

1.一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：包括以下步驟，

1)選取56頭荷斯坦奶牛，人工采精各1.5ml，測(cè)定精液品質(zhì)數(shù)據(jù)，并采用常規(guī)酚、氯仿法提取精子DNA，電泳及測(cè)定OD260/280法檢測(cè)DNA質(zhì)量；

2)根據(jù)GenBank序列NC_037350.1，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增荷斯坦奶牛miR-6531前體區(qū)域序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果；

3)荷斯坦奶牛miR-6531前體區(qū)域73位點(diǎn)存在一個(gè)T→C突變，產(chǎn)生一個(gè)BspE I酶切位點(diǎn)，利用BspE I限制性?xún)?nèi)切酶，對(duì)所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，將獲得427bp片段的定義為T(mén)T型，獲得427bp、250bp、177bp三個(gè)片段的定義為T(mén)C型，獲得250bp、177bp兩個(gè)片段的定義為CC型；

4)采用單因素方差分析比較不同基因型間各精液品質(zhì)指標(biāo)的差異，結(jié)果表明CC型奶牛個(gè)體的精液品質(zhì)顯著高于TT型，選擇CC型和TC型個(gè)體留種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述56頭荷斯坦奶牛及其精液品質(zhì)數(shù)據(jù)均由山東省奧克斯種業(yè)有限公司提供，所述精液品質(zhì)數(shù)據(jù)包括采精量、鮮精活力、精子密度和精子畸形率。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述步驟2)中特異性引物序列為

P1：GCAGAGCGTGTCTTAGTTA(SEQ ID NO.1)，

P2：CCGTCAGGTACTCCAACA(SEQ ID NO.2)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述miR-6531前體區(qū)73T/C多態(tài)位點(diǎn)是根據(jù)牛SNP公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables；Bos_taurus_UMD3.1.1；SNP14)并利用miRNAQTLsnp軟件篩選得到。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述步驟3)中，BspEI酶切位點(diǎn)為T(mén)CTGGA→TCCGGA，所述BspEI限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)買(mǎi)自ThermoFisher公司，所述凝膠成像系統(tǒng)型號(hào)為T(mén)anon 3500，購(gòu)買(mǎi)自上海天能公司。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述miR-6531前體區(qū)域序列，序列NC_037350.1，76964883-76965460bp。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述PCR反應(yīng)總體系20μL，模板DNA50-100ng，2xTaq聚合酶Mix 10μL，引物各0.5μL，加滅菌雙蒸水至20μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述酶切反應(yīng)體系20μL，PCR產(chǎn)物5μL，10U/μL BspE I酶0.5μL，10×緩沖液2μL，滅菌雙蒸水12.5μL；55℃酶切3h。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：所述荷斯坦奶牛不同miR-6531基因型間各精液品質(zhì)差異顯著性分析，采用SPSS 10中的One-way ANOVA方法進(jìn)行。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于：包含權(quán)利要求1～7所述的分子標(biāo)記、檢測(cè)方法但不僅限于此種方法。