[發明專利]一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用

在審

• 申請號: 202111284358.8
• 申請日: 2021-11-01
• 公開（公告）號: CN115369100A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 張煒;厲從志;李敏;李培
• 申請（專利權）人: 南京悅聯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/70;C12N15/56;A61K38/47;A61P31/04;A01N63/50;A01P1/00
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本發明公開了一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的解聚酶Depo58及應用，該噬菌體解聚酶Depo58的制備包括如下步驟：S1.通過PCR及基因片段純化獲得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pET28a質粒上，得到pET28a?depo58質粒；S2.將pET28a?depo58質粒轉化到大腸桿菌BL21。基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用：通過對肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框（orf58），進行原核表達和純化而獲得了噬菌體解聚酶Depo58，該解聚酶能夠清除KL2型肺炎克雷伯菌所形成的莢膜多糖，并且具有對生物被膜的形成具有高效的抑制作用的潛力，可廣泛應用于制備抗生素替代制劑及醫療器械消毒劑中，具有顯著地臨床效果。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體為一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用。

背景技術

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種常見的人畜共患病原菌，近年來，多重耐藥肺炎克雷伯菌已成為醫源性感染的最主要病原體之一，該細菌不但對人類公共衛生事業造成了巨大威脅，而且在一定程度影響了動物養殖業的健康發展。

大多數肺炎克雷伯菌具有合成和分泌莢膜多糖的能力，莢膜多糖作為細菌的天然屏障可維持細菌毒力、粘附、阻斷一些抗生素滲透，作為肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，莢膜多糖對公眾健康構成巨大威脅，此外，一些肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由細菌自身產生的胞外多糖基質、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細菌細胞所形成的膜狀結構，能顯著提高細菌對抗生素的耐藥性及逃避宿主免疫系統識別的能力，從而加速細菌在病灶內的定植，因此，生物被膜是醫院內細菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能夠穩定地附著于醫用器械表面，通過常規物理化學手段難以清除，這給防控醫療繼發感染帶來了嚴峻考驗。

噬菌體解聚酶（depolymerase）通過降解細菌表面多糖，進而引導噬菌體吸附于宿主外膜蛋白。該酶通過隨機攻擊糖苷鍵以釋放聚合物的重復單元，實現靶向降解莢膜多糖，諸多國內外研究表明，噬菌體解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共衛生領域具備一定的應用潛力。但是，不同來源、不同核酸序列以及不同蛋白結構的噬菌體解聚酶，對不同類型的莢膜多糖和生物被膜所表現的降解性能也是有非常大的差別。

例如，文獻：“Biological properties and genomics analysis of vB_KpnS_GH-K3, a Klebsiella phage with a putative depolymerase-like protein，Virus Genes(2019) 55:696–706”公開了一種噬菌體解聚酶樣蛋白，該蛋白表明只對K2型起作用，對KL2型的肺炎克雷伯菌的莢膜多糖和生物被膜并沒有降解效果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，以解決上述背景技術中提出的肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由細菌自身產生的胞外多糖基質、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細菌細胞所形成的膜狀結構，能顯著提高細菌對抗生素的耐藥性及逃避宿主免疫系統識別的能力，從而加速細菌在病灶內的定植，生物被膜是醫院內細菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能夠穩定地附著于醫用器械表面，通過常規物理化學手段難以清除，這給防控醫療繼發感染帶來了嚴峻考驗，同時噬菌體解聚酶樣蛋白，該蛋白表明只對KL2型起作用，對其他K型的肺炎克雷伯菌的莢膜多糖和生物被膜并沒有降解效果。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，該噬菌體解聚酶Depo58的制備與對肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解包括如下步驟：

S1.通過PCR方法獲得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pET28a質粒上，得到pET28a-depo58質粒；