[發明專利]一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用

在審

• 申請號: 202111284358.8
• 申請日: 2021-11-01
• 公開（公告）號: CN115369100A
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 張煒;厲從志;李敏;李培
• 申請（專利權）人: 南京悅聯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/70;C12N15/56;A61K38/47;A61P31/04;A01N63/50;A01P1/00
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1.一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：該噬菌體解聚酶Depo58的制備與對肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解包括如下步驟：

S1.通過PCR及基因片段純化獲得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pET28a質粒上，得到pET28a-depo58質粒；

S2.將pET28a-depo58質粒轉化到大腸桿菌BL21，篩選得到BL21-depo58大腸桿菌，將該BL21-depo58大腸桿菌在1L含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至對數生長期；

S3.向上述LB液體培養基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度為0.3 mM，并在16℃和180轉/分振蕩誘導表達16小時；

S4.將誘導表達的BL21-depo58菌液離心集菌離心后進行超聲破碎，將上清液樣品加入Ni-NTA親和層析柱，洗滌Ni柱以去除雜蛋白，最后收集洗脫液并經超濾得到純化的噬菌體解聚酶Depo58；

S5.隨后將含有100 μL對數期細菌的0.5%半固體LB培養基均勻平鋪在固體LB培養基上，自然晾干后，取5 μL稀釋濃度的Dpo58滴在雙層平板上，緩沖液作為陰性對照，37℃培養箱中靜置培養過夜，濃度為100、25、6.256、1.56、0.39和0.097 μg/mL的噬菌體解聚酶Depo58使平板上形成半透明的斑點。

2.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌噬菌株P719，名為Klebsiellaphage P719。

3.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述該噬菌體解聚酶Depo58為肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框的原核表達和純化產物。

4.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述該噬菌體解聚酶Depo58的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

5.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌包括KL2型肺炎克雷伯菌。

6.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述S1中肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位開放閱讀框的depo58基因PCR產物經純化后連接至pET28a質粒的酶切位點為NdeI和XhoI。

7.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述用于構建解聚酶表達載體的上游引物F（SEQIDNo:3）的DNA序列為：

5’-gtgccgcgcggcagccatATGGCACTATACAGACAAGGCAAA-3’。

8.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：所述用于構建解聚酶表達載體下游引物R（SEQIDNo:4）的DNA序列為：

5’-gtggtggtggtggtgctcgagTTAGATAAAGTTTATTAGAACGCCATCG-3’。

9.根據權利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌體解聚酶Depo58及應用，其特征在于：該解聚酶Depo58可對KL2型肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解。