[發明專利]一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法

在審

• 申請號: 202111283371.1
• 申請日: 2021-11-01
• 公開（公告）號: CN113913338A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 盧燦華;姜寧;蓋曉彤;曹爭花;馬俊紅;王繼明;何元勝;韓天華;廖德智;殷紅慧;胡加云;王朝富;晉艷;夏振遠
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/38
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 胡晗

本發明公開了一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，該方法包括以下步驟：S1：病樣采集；S2：病原菌分離；S3：病原菌培養和篩選；S4：菌落PCR菌懸液制備；S5：PCR擴增與鑒定；S6：16S rRNA基因擴增與驗證。本發明能快速而準確地獲得煙草黑斑病病原菌，有效排除其他雜菌，提高分離純化效率，分離純化率在87％以上；通過采用細菌性黑斑病病原菌的特異引物對灰色菌落進行PCR擴增確認，增強了目標菌株的選擇性，可以快速鑒別病原菌。

技術領域

本發明涉及煙草病害鑒定技術領域，具體涉及一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法。

背景技術

煙草葉片是煙草采收的主要位置，卷煙制品品質的優劣與煙葉質量直接相關，其品質的重要性不言而喻，同時煙葉也是受病蟲害影響最為嚴重的部位。煙葉病害主要分為病毒、真菌和細菌性三類病害。其中，病原細菌引起的葉部病害包括：由扁桃假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonas amygdalipv.tabaci引起的野火病(wildfire of tobacco)、角斑病(angular leaf spot of tobacco)；銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)引起的苗期細菌性葉斑病；胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacteriumcarotovorum subsp.brasiliense)引起的細菌性葉枯病；野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)侵染引起的細菌性葉斑病；蠟質芽孢桿菌(Bacillus cereus)引起的劍葉病(frenchingoftobacco)。

其中，野火病和角斑病是常見的煙草細菌性病害。煙草野火病主要發生在大田期，癥狀初為水漬狀小斑點，隨著病害加深、病斑擴大，中心變為褐色，有螺紋，病斑周圍有明顯的黃綠色暈圈，野火病在田間可通過風雨傳播，從自然孔口或傷口侵染，造成野火病具有爆發性強、破壞性大的特點。角斑病多發生在生長中后期，葉片呈多角形或不規則形，邊緣清晰，故稱角斑病，隨著病害加深，病斑擴大，病斑之間相互聯合，干燥后開裂、脫落，葉片破碎，在葉背有菌膿溢出，干后形成一層膜。

2019年9月中旬，本申請發明人于云南省麗江市古城區大東鄉種植的云煙105、云煙87上發現一種新的煙草葉部病害，此煙草細菌性黑斑病是近年來在云南省發現的國內新病害，病害危害整株煙葉，下部葉片較重；病斑多為不規則形黑斑，黑斑較大，有時受到葉脈、側脈的限制，病斑表面無霉層，暈圈較少，與已知的角斑病和野火病明顯不同，稱為煙草細菌性黑斑病，目前，煙草細菌性黑斑病的研究基礎較為薄弱，尚無快速分離、鑒定病原菌的方法。

鑒于上述情況，有必要研究一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法以解決上述技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，該方法能快速而準確地獲得煙草黑斑病病原菌，有效排除其他雜菌，提高分離純化效率；本發明細菌性黑斑病病原菌的特異引物對灰色菌落進行確認，可以快速鑒別病原菌。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提出一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，該方法包括以下步驟：

S1：病樣采集：采集田間帶有煙草細菌性黑斑病病斑的病葉，將病葉放入采樣袋，帶回實驗室；

S2：病原菌分離：將步驟S1中帶有病斑的煙草細菌性黑斑病病葉用流動自來水沖洗3-5次，取若干個病健交界處的新鮮病斑，于無菌培養皿中消毒后進行漂洗；將漂洗好的病斑切成若干塊組織塊，將組織塊置于含有10-20mL無菌水的滅菌培養皿中浸泡5-10min，待組織塊周圍有乳白色菌液溢出后，搖晃培養皿使菌液混勻得到菌懸液；