[發明專利]一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法

在審

• 申請號: 202111283371.1
• 申請日: 2021-11-01
• 公開（公告）號: CN113913338A
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 盧燦華;姜寧;蓋曉彤;曹爭花;馬俊紅;王繼明;何元勝;韓天華;廖德智;殷紅慧;胡加云;王朝富;晉艷;夏振遠
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/38
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 胡晗

1.一種煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

S1：病樣采集：采集田間帶有煙草細菌性黑斑病病斑的病葉，將病葉放入采樣袋，帶回實驗室；

S2：病原菌分離：將步驟S1中帶有病斑的煙草細菌性黑斑病病葉用流動自來水沖洗3-5次，取若干個病健交界處的新鮮病斑，于無菌培養皿中消毒后進行漂洗；將漂洗好的病斑切成若干塊組織塊，將組織塊置于含有10-20mL無菌水的滅菌培養皿中浸泡5-10min，待組織塊周圍有乳白色菌液溢出后，搖晃培養皿使菌液混勻得到菌懸液；

S3：病原菌培養和篩選：用移液器吸取步驟S2中的菌懸液30-50μL于NA培養基平板中，用無菌牙簽劃線稀釋菌懸液，置于超凈工作臺吹干；吹干后放入28-30℃培養箱中暗培養36-49h，培養23-25h后形成若干小單菌落，培養47-49h后單菌落呈淺灰色，將淺灰色單菌落于常溫或4℃環境放置2-5d后單菌落呈深灰色；

S4：菌落PCR菌懸液制備：于滅菌離心管中加入10-100μL無菌水，用滅菌牙簽挑取一個步驟S3中呈深灰色的單菌落于無菌水中，置于漩渦震蕩儀上震蕩混勻制成菌落PCR菌懸液；

S5：PCR擴增與鑒定：取步驟S4中的菌落PCR菌懸液0.5-2μL，用煙草細菌性黑斑病菌特異性引物PcF和PcR進行菌落PCR擴增，PCR擴增結束得PCR產物；取5-10μLPCR產物，上樣于0.8-1.5％的瓊脂糖凝膠的膠孔中，在120-145V恒壓下分離30-45min，并在含有5-10μg/mL的EB核酸染液中染色10-20min；置于凝膠成像儀上獲取PCR產物分離情況，若為煙草細菌性黑斑菌則在750和1000bp之間有特異的擴增條帶；

S6：16S rRNA基因擴增與驗證：將菌落PCR擴增為陽性的菌用LB培養基搖培24h，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用16S rRNA基因擴增的通用引物27F和1492R進行PCR擴增，擴增后條帶大小為1540bp，將擴增產物進行測序，分析測序結果確定病原菌。

2.根據權利要求1所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，所述步驟S1中的病葉上的病斑為不規則的大黑斑，黑斑表面無霉層，黑斑邊緣暈圈不明顯，黑斑邊緣會受葉脈或側脈限制。

3.根據權利要求1所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，所述步驟S2中的新鮮病斑取10個以上；所述消毒為用75％酒精表面消毒5s，再用0.5％次氯酸鈉消毒5min；所述漂洗為用無菌水漂洗3次；所述組織塊的大小為0.5×0.5cm²。

4.根據權利要求1所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，所述步驟S3中NA培養基平板的制作方法為：分別稱取18g營養肉湯、15.0g瓊脂，加蒸餾水定容至1L，121℃高壓滅菌20min后置于55℃水浴鍋，待培養基溫度降至60°左右時，在每個無菌培養皿中加入23-28mL培養基，冷凝后制成的平板為NA平板。

5.根據權利要求1所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，所述步驟S5中引物PcF的序列為5’-CCGTTCATCGTCATCGACCT-3’，引物PcR的序列為5’-CTGTCCCACATGATCTGGGT-3’。

6.根據權利要求5所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，所述步驟S5中PCR鑒定的反應體系為25μL，反應體系由12μL 2×Es TaqMasterMix(Dye)、12μLddH₂O、0.5μL 10μM PcF、0.5μL 10PcR和0.5～2.0μL菌懸液組成；菌落PCR反應條件為94℃預變性2min，擴增循環包括94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，擴增30個循環，最后72℃延伸2min，將PCR產物保存于16℃或直接用于瓊脂糖凝膠電泳。

7.根據權利要求6所述的煙草細菌性黑斑病病原菌的分離和鑒定方法，其特征在于，步驟S5中所述的750和1000bp之間有特異的擴增條帶具體為位于897bp處的條帶。