[發明專利]一種低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑

在審

• 申請號: 202111276416.2
• 申請日: 2021-10-29
• 公開（公告）號: CN113897326A
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 曾維愛;尹華群;謝鵬飛;譚格;翟爭光;蔡海林;陳金;鐘越峰;李建勇;趙阿娟
• 申請（專利權）人: 湖南省煙草公司長沙市公司;中南大學
• 主分類號: C12N1/22
• 分類號: C12N1/22;C12N1/20;A01N63/27;A01N63/20;A01P21/00;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 長沙軒榮專利代理有限公司 43235
• 代理人: 黃藝平

1.一種低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括以下步驟：

S1:取煙草根際土壤加入無菌水，震蕩靜置后獲得細菌收集液；

S2:將所述細菌收集液涂布于羧甲基纖維素培養基和木質素選擇培養基上分別進行篩選培養分別獲得耐冷纖維素降解假單胞菌和耐冷木質素降解寡養單胞菌；

S3:將所述耐冷纖維素降解假單胞菌和耐冷木質素降解寡養單胞菌分別接種至LB液體培養基中進行擴大培養獲得耐冷纖維素降解假單胞菌液和耐冷木質素降解寡養單胞菌液；

S4:將所述耐冷纖維素降解假單胞菌液和耐冷木質素降解寡養單胞菌液經濃度調節后按照1：0.5-2的體積比進行混合獲得低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑。

2.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中的震蕩靜置過程具體為：震蕩1-3h后靜置30-40min。

3.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中的羧甲基纖維素培養基為:CMC-Na 15.0g，(NH₄)₂·SO₄ 1.0g，酵母膏1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1.0g，NaCl 0.3g，瓊脂15-20g，補加蒸餾水至1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min；

所述獲得耐冷纖維素降解假單胞菌的篩選培養具體過程為：在溫度為10-14℃條件下培養30-36h。

4.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中的木質素選擇培養基：蛋白胨1.0g，堿性木質素3.0g，NaCl 5.0g，pH值自然，瓊脂15-20g，補加蒸餾水至1000mL，pH值自然，121℃高壓蒸汽滅菌20min；

所述獲得耐冷木質素降解寡養單胞菌的篩選培養具體過程為：在溫度為12-15℃條件下培養32-38h。

5.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中的LB液體培養基為：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂15-20g、補加蒸餾水至1000mL，pH值7.0-7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

6.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述耐冷纖維素降解假單胞菌擴大培養的過程具體為：

將耐冷纖維素降解假單胞菌按照接種量為2-6％進行接種，在初始pH為7.0，溫度10-14℃、轉速150-200rpm條件下搖床震蕩培養30-36h，培養至對數生長期，獲得耐冷纖維素降解假單胞菌種子液，菌濃為1.0×10⁸～2.0×10⁹CFU/mL，并接種于新的LB液體培養基中，進行發酵獲得耐冷纖維素降解假單胞菌液。

7.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述耐冷木質素降解寡養單胞菌擴大培養的過程具體為：

將耐冷木質素降解寡養單胞菌按照接種量為2-5％進行接種，在初始pH為7.2，溫度12-15℃、轉速150-180rpm條件下搖床震蕩培養32-38h，培養至對數生長期，獲得耐冷纖維素降解假單胞菌種子液，菌濃為1.0×10⁸～2.0×10⁹CFU/mL，并接種于新的LB液體培養基中，進行發酵獲得耐冷木質素降解寡養單胞菌液。

8.根據權利要求1所述的低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑的制備方法，其特征在于，所述步驟S4中濃度調節過程具體為：將所述耐冷纖維素降解假單胞菌液和耐冷木質素降解寡養單胞菌液分別經離心收集菌體細胞，并采用磷酸鹽緩沖液重新懸浮獲得濃度為OD₆₀₀＝1.0±0.05。

9.一種低溫型煙草根系促生微生物功能菌劑，其特征在于，所述微生物功能菌劑由權利要求1-8任意所述的制備方法獲得。