[發(fā)明專利]荔枝轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111274801.3
• 申請(qǐng)日: 2021-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN113930443B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙明磊;謝涵涵;李建國(guó);徐珊珊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/65;A01H5/06;A01H6/00
• 代理公司: 廣州市諾豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44714
• 代理人: 任毅;黃國(guó)亮

本發(fā)明公開了一種荔枝轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。通過(guò)本發(fā)明的構(gòu)建方法在荔枝實(shí)生苗上成功構(gòu)建了荔枝轉(zhuǎn)基因體系，在荔枝的轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因功能驗(yàn)證具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為荔枝的品種選育和品種改良提供的研究工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種荔枝轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是原產(chǎn)于我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)常綠果樹。荔枝營(yíng)養(yǎng)豐富，具有優(yōu)良的果實(shí)品質(zhì)，因而備受消費(fèi)者的喜愛(ài)。但是荔枝不耐貯運(yùn)，并且穩(wěn)產(chǎn)性不高，所以急需建立荔枝轉(zhuǎn)基因體系，促進(jìn)品種的選育和品種改良的進(jìn)程。但目前的研究中，尚未報(bào)道荔枝實(shí)生苗上成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種荔枝轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建方法。

在一些實(shí)施方式中，所述荔枝轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟a：荔枝種子消毒后于無(wú)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得荔枝實(shí)生苗；

步驟b：活化農(nóng)桿菌得到侵染用農(nóng)桿菌菌液，所述農(nóng)桿菌中攜帶有目的基因；

步驟c：使用所述農(nóng)桿菌菌液創(chuàng)傷侵染荔枝實(shí)生苗；

步驟d：恢復(fù)培養(yǎng)后荔枝實(shí)生苗上獲得到轉(zhuǎn)基因根。

在一些實(shí)施方式中，所述無(wú)菌培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。

在一些實(shí)施方式中，所述荔枝實(shí)生苗是指苗期為20-30天的荔枝實(shí)生苗；優(yōu)選地，所述荔枝實(shí)生苗是指苗期為25天的荔枝實(shí)生苗。

在一些實(shí)施方式中，所述農(nóng)桿菌為Ar.Qual發(fā)根農(nóng)桿菌。

在一些實(shí)施方式中，所述農(nóng)桿菌中含有篩選質(zhì)粒；優(yōu)選地，所述篩選質(zhì)粒中含有報(bào)告基因RUBY；更優(yōu)選地，所述報(bào)告基因RUBY由35S啟動(dòng)子引導(dǎo)表達(dá)。

報(bào)告基因RUBY中包括甜菜堿生物合成基因 CYP76AD1、DODA和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，這三個(gè)基因通過(guò)2A 肽相連。當(dāng)其表達(dá)時(shí)可以產(chǎn)生甜菜堿生物合成所需的所有酶，可用于來(lái)追蹤基因表達(dá)或可視化轉(zhuǎn)基因。關(guān)于報(bào)告基因RUBY的描述詳見(jiàn)：He, Yubing , Zhang, Tao ,Sun, Hui , Zhan, Huadong , Zhao, Yunde. A reporter for noninvasivelymonitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research,2020, 7(1)。本發(fā)明中通過(guò)在農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入含有報(bào)告基因RUBY的篩選質(zhì)粒，可以非常簡(jiǎn)便直觀地確認(rèn)轉(zhuǎn)基因是否成成功。

在一些實(shí)施方式中，所述步驟b具體為：將含有目的基因的農(nóng)桿菌加入TY液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，離心重懸后，將菌液涂布在含有鏈霉素、卡那霉素的TY固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天，挑單菌落于含有鏈霉素、卡那霉素和乙酰丁香酮的TY液體培養(yǎng)基中，28℃、220 rmp振蕩培養(yǎng)得到侵染用農(nóng)桿菌菌液。

在一些實(shí)施方式中，所述農(nóng)桿菌菌液的OD₆₀₀值為0.5-0.7；優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌菌液的OD₆₀₀值為0.6。

在一些實(shí)施方式中，所述步驟c具體為：使用注射器吸取所述農(nóng)桿菌菌液創(chuàng)傷侵染荔枝實(shí)生苗的莖，然后避光靜置。

在一些實(shí)施方式中，所述步驟c具體為：使用注射器吸取所述農(nóng)桿菌菌液創(chuàng)傷侵染荔枝實(shí)生苗的莖，然后避光靜置30-45min，然后再次使用注射器吸取所述農(nóng)桿菌菌液創(chuàng)傷侵染荔枝實(shí)生苗的莖上同一傷口，然后避光靜置1-2h。