[發明專利]一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202111267114.9
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113943775A
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發明（設計）人: 徐秦峰;李艷妮;張文娟;路夢凡;王芳;劉楠
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/686
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 高博

本發明公開了一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法。在PCR反應之前利用Cas12a蛋白的順式切割活性特異性地破壞管底的交叉污染物；利用PCR反應使管底的Cas12a蛋白變性，消除其對PCR反應的抑制作用，獲得擴增產物；利用海藻糖對提高Cas12a蛋白熱穩定性的作用、礦物油隔熱的作用和PCR儀器的管蓋控溫的作用，防止管蓋上的Cas12a蛋白失活，從而利用其反式切割活性特異性地檢測擴增產物，實現了交叉污染消除、PCR擴增和熒光可視化檢測的閉管聯用。該方法具有特異性強、準確性高、操作及引物、crRNA、探針序列設計簡單、閉管操作、高效消除交叉污染的特點，為核酸定性分析提供了新的途徑。

技術領域

本發明涉及一種核酸檢測方法，具體涉及一種基于CRISPR-Cas12a建立的可消除擴增產物交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法。

背景技術

PCR技術是最早應用于核酸分子分析的技術，雖然等溫擴增技術已經發展成為另一種很有前途的替代技術，但PCR技術作為目前最為成熟的一種核酸擴增技術，仍應用于環境監測、食品安全等各個需要進行快速、靈敏核酸檢測的領域。然而由于PCR的高度敏感性及開管操作，擴增產物交叉污染一直是PCR技術在核酸檢測應用中的主要障礙。一種最可能造成PCR反應的擴增產物污染的形式是氣溶膠污染，例如在操作時比較劇烈地搖動反應管、開蓋、吸樣以及污染進樣槍的反復吸樣，都可形成氣溶膠而造成交叉污染。因為PCR反應的擴增產物數量大，遠遠高于PCR檢測的極限(數個拷貝)，所以極微量的交叉污染物就可造成假陽性。利用實時定量PCR檢測擴增產物，但結果只有擴增和不擴增兩種情況，并不能區分出特異性擴增和非特異性擴增；而利用凝膠電泳檢測擴增結果，需要開管后進行操作，又會造成氣溶膠污染。

聚類規則間隔的短回文重復序列系統由聚類規則間隔的短回文重復序列(CRISPR)和相關蛋白組成。CRISPR-Cas12a(LbCpf1)，即Cas12a蛋白是Cas效應蛋白家族的成員(Cell,2015,163,759-771)。Cas12a蛋白作為一種可編程的核酸內切酶，可在一條長度為41～44個核苷酸的crRNA的引導下，特異性識別包含PAM位點的dsDNA，并在PAM位點附近特定位點裂解目標鏈；而且Cas12a/crRNA/DNA(ssDNA或含有PAM位點的dsDNA)三元復合物也可裂解附近非特異性ssDNA(Science,2018,360,436-439；Cell Research,2018,28,491-493)。

目前核酸檢測中對Cas效應蛋白的應用分為兩方面，一是作為檢測工具，二是用于消除交叉污染。Bao等采用CRISPR-Cas9體系消除了LAMP擴增交叉污染，但PCR反應最高溫度可達95℃，該體系并不能適用于PCR(ACS Sens.,2020,5,1082-1091)，Cas12a蛋白同樣無法耐受如此高的反應溫度。Cas12a蛋白目前僅有報道將其作為檢測工具。利用CRISPR-Cas12a體系優異的靶基因序列特異性識別能力和Cas12a蛋白高效的反式切割活性，能夠實現PCR反應的快速準確檢測，例如中國專利CN113025749A，但該專利中的檢測體系成份復雜，且并未考慮交叉污染風險。LI等將crRNA/Cas12a蛋白與PCR聯用，開發了快速靈敏的HOLMES(anone-Hour Low-costMultipurpose highly EfficientSystem)系統，但該系統在檢測時需經過兩步反應，容易造成交叉污染(Cell discovery,2018,4,20)。Zhang等開發的方法也將PCR和Cas12a蛋白聯用，且實現了閉管以減少交叉污染的風險，但該方法在PCR反應階段不能關閉儀器的蓋子(防止Cas12a蛋白在關閉蓋子后因高溫而失活)，同時僅僅閉管是無法消除交叉污染的(Talanta,2020,214,120818)。同樣為了消除交叉污染，Qian等將UDG酶引入CRISPR-Cas12a檢測體系(Anal.Chem.,2019,91,11362-11366)，但dUTP會影響擴增效率，且UDG酶法局限于短序列和高GC含量的污染物，不適用于對含尿嘧啶的模板DNA的檢測。