[發(fā)明專利]一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111267114.9
• 申請(qǐng)日: 2021-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN113943775A
• 公開（公告）日: 2022-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐秦峰;李艷妮;張文娟;路夢(mèng)凡;王芳;劉楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/686
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 高博

1.一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括帶有Cas12a蛋白識(shí)別位點(diǎn)的PCR引物以及用于導(dǎo)引Cas12a蛋白對(duì)交叉污染物進(jìn)行順式切割的第一crRNA和第二crRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR引物包括第一引物和第二引物，第一引物、第二引物分別包括用于擴(kuò)增目標(biāo)片段的正向引物、反向引物的對(duì)應(yīng)核苷酸序列，以及分別插入在正向引物、反向引物的5’末端的PAM位點(diǎn)的核苷酸序列；第一crRNA包括用于與第一引物所引入的擴(kuò)增子PAM位點(diǎn)的鄰近區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別的核苷酸序列，第二crRNA包括用于與第二引物所引入的擴(kuò)增子PAM位點(diǎn)的鄰近區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括用于與PCR引物共同在反應(yīng)管管底建立目標(biāo)片段的PCR反應(yīng)體系的試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述第一crRNA和第二crRNA按照終濃度分別為0.025-0.06μmol/L加載于PCR反應(yīng)體系中，Cas12a蛋白按照終濃度為0.06-0.1μmol/L加載于PCR反應(yīng)體系中，用于擴(kuò)增目標(biāo)片段的模板按照終濃度為1×10^-5-1×10^-2μmol/L加載于PCR反應(yīng)體系中；PCR引物在加載有第一crRNA、第二crRNA、Cas12a蛋白及模板的PCR反應(yīng)體系中的濃度為0.2-0.4μmol/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括儲(chǔ)存在反應(yīng)管管蓋的反式切割反應(yīng)體系，反式切割反應(yīng)體系包括修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈DNA探針以及用于引發(fā)Cas12a蛋白對(duì)該單鏈DNA探針進(jìn)行反式切割的第三crRNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述反式切割反應(yīng)體系中，第三crRNA的濃度為0.025-0.06μmol/L，單鏈DNA探針的濃度為0.1-0.3μmol/L，Cas12a蛋白的濃度為0.06-0.1μmol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種消除交叉污染的PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括用于對(duì)反式切割反應(yīng)體系內(nèi)的Cas12a蛋白進(jìn)行熱穩(wěn)定保護(hù)的試劑海藻糖和/或用于對(duì)反應(yīng)管管底的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行隔熱封閉的試劑，海藻糖在反式切割反應(yīng)體系中的濃度為0.5-0.7mol/L。

8.一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法，其特征在于：該檢測方法包括以下步驟：

在不同crRNA的定位識(shí)別作用下，利用Cas12a蛋白特異性靶向PCR反應(yīng)體系中的交叉污染物，并利用該Cas12a蛋白所具有的順式切割活性破壞交叉污染物；在通過PCR反應(yīng)獲得新的擴(kuò)增產(chǎn)物后，利用處于同一反應(yīng)管中并位于PCR反應(yīng)體系之外的Cas12a蛋白對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的靶向性以及該Cas12a蛋白的反式切割活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的可視化檢測。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法，其特征在于：所述檢測方法具體包括以下步驟：在反應(yīng)管管底的PCR反應(yīng)進(jìn)行之前，利用Cas12a蛋白與污染消除crRNA所形成的Cas12a蛋白/crRNA復(fù)合物水解相應(yīng)PCR反應(yīng)體系中的交叉污染物，污染消除crRNA包括用于與PCR引物所引入的擴(kuò)增子PAM位點(diǎn)的鄰近區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別的核苷酸序列；然后經(jīng)PCR反應(yīng)使該Cas12a蛋白失活，并在PCR反應(yīng)中防止反應(yīng)前加載在反應(yīng)管管蓋的Cas12a蛋白失活；然后通過該Cas12a蛋白與產(chǎn)物檢測crRNA及擴(kuò)增產(chǎn)物所形成的Cas12a蛋白/crRNA/dsDNA復(fù)合物在PCR反應(yīng)結(jié)束后水解修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈DNA探針，根據(jù)熒光顯色結(jié)果即可判斷目標(biāo)片段得到擴(kuò)增。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述一種消除交叉污染的閉管可視化PCR檢測方法，其特征在于：在利用覆蓋在PCR反應(yīng)體系表面的試劑的隔熱封閉作用及PCR儀器對(duì)反應(yīng)管管蓋的控溫作用的基礎(chǔ)上，結(jié)合加載在反應(yīng)管管蓋的海藻糖的熱穩(wěn)定保護(hù)作用，從而使得加載在反應(yīng)管管蓋的Cas12a蛋白在PCR反應(yīng)的過程中不發(fā)生變性失活。