[發(fā)明專利]雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒及其在定量檢測狂犬病毒中的用途

在審

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• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113930436A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發(fā)明（設計）人: 賈小營;王國輝;江松寰;吳晶;姬紅衛(wèi);廉維;白楊;鄭洪娟;趙麗娟;李超;何玉友
• 申請（專利權）人: 吉林正業(yè)生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發(fā)明公開了雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒及其在定量檢測狂犬病毒中的用途。該陽性標準品質粒的構建方法包括：分別以鼠源GAPDH基因以及狂犬病毒株的基因組為模板進行PCR擴增得到鼠源GAPDH基因片段以及狂犬病毒基因片段；將擴增的兩種基因片段分別與pMD18?T載體可操作性的連接，即得。本發(fā)明進一步公開了采用所構建的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒建立雙標準曲線熒光定量RT?qPCR方法，該方法可以對樣品狂犬病毒的表達量進行準確檢測，能夠在狂犬病毒復制的任意時間檢測鼠源細胞的復制或小鼠中狂犬病毒的表達情況，具有耗時短、特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及陽性標準品質粒，尤其涉及雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒及其構建方法，本發(fā)明進一步涉及采用該雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒在定性或定量檢測狂犬病毒中的用途，屬于病毒陽性標準品質粒及其應用領域。

背景技術

狂犬病毒(Rabies virus,RV)是一種由單股負鏈的RNA病毒，屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)。如今，狂犬病毒在世界范圍內都有發(fā)現(xiàn)，其可引起多種宿主的致命性病毒性腦炎。在各種狂犬病感染的宿主中，家犬對全球公共健康的威脅是最大的。由狗造成的狂犬病每年估計造成59,000人死亡(95％CI 25,000–159,000)。盡管控制人畜共患疾病仍舊非常復雜，但歷史經驗表明，消除狗介導的狂犬病病毒是可行且具有效的。高收入國家通過狗用疫苗和人口管理方案，狗介導的狂犬病已經從幾乎在這些國家中消失。低收入和中等收入國家的通過犬狂犬病控制工作，估計每年可預防290萬的人類狂犬病死亡。在狂犬病毒疫苗的研發(fā)過程中需要精確的測定狂犬病毒的含量，最經典的方法仍舊是檢測病毒的滴度。但隨著檢測技術的更新，病毒滴度的檢測具有耗時長、存在人為誤差等缺點。

實時熒光定量PCR(real-time PCR)自1990年發(fā)展起來之后，其已成為一種便捷、快速、準確的核酸檢測技術。其反應的主要原理是在PCR反應體系中加入一種可與雙鏈DNA結合的熒光化學物質，并且對每一輪循環(huán)后對反應體系進行熒光強度的測定，進而得到一條由發(fā)光強度構成的曲線，最后與已知的標準品進行比較、換算進而確定未知樣品中模板的初始濃度，其具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點,成為了分子生物學檢測中的重要工具。由于樣品在前期準備過程中可能存在不同樣品含量不同，或在反轉錄過程中由于試劑添加條件不同進而導致后期檢測過程中不能準確反映樣品的真實數(shù)據(jù)。

相比之下，雙標準曲線熒光定量RT-qPCR檢測方法具有耗時短，相對與單標準曲線的熒光定量方法具有更高的靈敏度等優(yōu)點。雙標準曲線熒光定量RT-qPCR技術需在之前的基礎上增加一條內參基因的標準曲線，進一步的消除不同樣品間可能存在的誤差。同時無需像比較Ct法那樣對試驗進行嚴格的優(yōu)化,基因擴增效率不要求達到100％這種理想狀態(tài),也不要求目的基因和看家基因有相同的擴增效率，從而在放寬實驗操作條件的同時進一步的加檢測方法的可靠性。

因此，建立一種雙標準曲線熒光定量RT-qPCR檢測狂犬病毒的方法，有利于提高檢測的靈敏度、可靠性和檢測效率。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的之一是構建一種用于熒光定量RT-qPCR檢測狂犬病毒表達量的雙標準曲線陽性標準品質粒；

本發(fā)明的目的之二是將所構建的雙標準曲線陽性標準品質粒建立一種檢測狂犬病毒的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR檢測方法，所述的檢測方法能可準確的測定BHK-21細胞和小鼠組織中狂犬病毒的表達量，同時具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優(yōu)點。

本發(fā)明的上述目的主要是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

本發(fā)明的一方面是提供了一種雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒，其構建方法包括：