[發明專利]雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒及其在定量檢測狂犬病毒中的用途

在審

• 申請號: 202111265745.7
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113930436A
• 公開（公告）日: 2022-01-14
• 發明（設計）人: 賈小營;王國輝;江松寰;吳晶;姬紅衛;廉維;白楊;鄭洪娟;趙麗娟;李超;何玉友
• 申請（專利權）人: 吉林正業生物制品股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.一種雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒，其特征在于，其構建方法包括：

(1)以鼠源GAPDH基因為模板進行PCR擴增得到鼠源GAPDH基因片段；(2)以狂犬病毒株的基因組為模板進行PCR擴增得到狂犬病毒基因片段；(3)將擴增的鼠源GAPDH基因片段以及狂犬病毒基因片段分別與pMD18-T載體可操作性的連接，即得。

2.按照權利要求1所述的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒，其特征在于，步驟(1)中以鼠源GAPDH基因為模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸為擴增引物進行PCR擴增得到鼠源GAPDH基因片段。

3.按照權利要求1所述的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒，其特征在于，步驟(2)中以狂犬病毒株的基因組為模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸為擴增引物進行PCR擴增得到狂犬病毒基因片段。

4.權利要求1-3任何一項所述的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒在制備定性或定量檢測狂犬病毒試劑中的應用。

5.一種非診斷或治療目的的檢測樣品中狂犬病毒復制或表達量的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，包括

(1)將權利要求1-3任何一項所述的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒進行梯度稀釋后為模板進行熒光定量PCR擴增，分別得到狂犬病毒的基因的標準曲線和鼠源GAPDH基因的標準曲線：

(2)提取待檢測樣品的總RNA后反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增，收集熒光信號進行熒光強度的測定得到由發光強度構成的曲線；將該曲線與步驟(1)的標準曲線進行比較、換算進而確定樣品中狂犬病毒的初始濃度。

6.按照權利要求5所述的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步驟(1)中所述的梯度稀釋是將構建的雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒稀釋至10¹copies/μL、10²copies/μL、10³copies/μL、10⁴copies/μL、10⁵copies/μL、10⁶copies/μL。

7.按照權利要求5所述的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步驟(1)中所述的熒光定量PCR擴增的反應體系是：SYBR Green I熒光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,雙標準曲線狂犬病毒陽性標準品質粒模板1μL,補ddH₂O至25μL；所述的上、下游引物的核苷酸序列份為SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

步驟(1)中所述的熒光定量PCR擴增的條件是：95℃變性10s，60℃退火30s，循環次數為40次；從60℃連續遞增到95℃。

8.按照權利要求5所述的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，步驟(2)中所述的熒光定量PCR擴增的反應體系是：SYBR Green I熒光染料12.5μL,上、下游引物各1μL,樣品cDNA模板1μL,補ddH₂O至25μL；所述的上、下游引物的核苷酸序列份為SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

步驟(2)中所述的熒光定量PCR擴增的條件是：95℃變性10s，60℃退火30s，循環次數為40次；從60℃連續遞增到95℃。

9.按照權利要求5所述的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，所述的待檢測樣品是感染狂犬病毒的鼠源細胞或感染狂犬病毒的動物模型。

10.按照權利要求9所述的雙標準曲線熒光定量RT-qPCR方法，其特征在于，所述的鼠源細胞為BHK-21細胞，所述感染狂犬病毒的動物模型是小鼠。