[發(fā)明專利]靶向超敏廣譜溶瘤病毒制備及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111259942.8
• 申請(qǐng)日: 2021-10-28
• 公開（公告）號(hào): CN113699123B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘莉娉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 旦旦生物科技（上海）有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/86;C12N15/40;C12N15/56;C12N15/13;A61K35/768;A61K48/00;A61K38/47;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 上海德禾翰通律師事務(wù)所 31319
• 代理人: 夏思秋

本發(fā)明公開了靶向超敏廣譜溶瘤病毒制備及應(yīng)用，所述靶向超敏廣譜溶瘤病毒為一種包含重組新城疫病毒、α?1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因質(zhì)粒的重組病毒，所述重組病毒由重組新城疫病毒NDV?GHF質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞拯救獲得。所述重組新城疫病毒NDV?GHF質(zhì)粒是將NDV與α?1,3 GT、HPSE和FAP scFv基因進(jìn)行重組后的重組新城疫病毒NDV?GHF質(zhì)粒；所述HPSE基因、FAP scFv基因、α?1,3 GT基因的序列分別如SEQ ID NO:1~3所示。本發(fā)明還公開了上述重組病毒的制備方法及重組病毒在融化腫瘤物理屏障中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種熔化腫瘤物理屏障的靶向超敏廣譜溶瘤病毒及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙酰肝素酶（heparanase，HPSE）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中唯一能切割細(xì)胞外基質(zhì)中硫酸肝素蛋白多糖側(cè)鏈（heparan sulfate chains，HS）的內(nèi)源性糖苷酶（即在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，乙酰肝素酶在腫瘤免疫監(jiān)視中起重要作用，一方面，激活自然殺傷細(xì)胞（natural killer，NKC）；另一方面，通過(guò)切割HS鏈和隨后的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解而破壞腫瘤組織中的物理屏障，趨化因子得以進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，吸引NK細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）向腫瘤部位聚集，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。

成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein FAP)是基質(zhì)中的一種表面抗原，多種惡性腫瘤都有表達(dá)。腫瘤組織需要通過(guò)新生血管與活化的成纖維細(xì)胞等基質(zhì)形成來(lái)獲取腫瘤細(xì)胞存活和生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中FAP含量豐富，可以激活基質(zhì)中的生長(zhǎng)因子等，以利于血管生成，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。在以腫瘤基質(zhì)為靶點(diǎn)的抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮作用，顯著誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的凋亡。FAP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)作為一種理想的抗腫瘤靶分子。將FAPscFv重組入NDV，溶解腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，破壞了腫瘤生長(zhǎng)的外基質(zhì)，破壞了種子成長(zhǎng)所需要的土壤，干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。

溶瘤病毒（oncolytic virus）是能特異性感染癌細(xì)胞并大量復(fù)制，最終裂解癌細(xì)胞后釋放出來(lái)，再感染更多癌細(xì)胞的一類病毒。新城疫病毒是一種天然的單股負(fù)鏈RNA非致病性溶瘤病毒，在癌細(xì)胞內(nèi)具有很高的復(fù)制效率（是正常細(xì)胞中的10000倍）和一定的溶瘤能力。NDV 通過(guò)與癌細(xì)胞表面所分布豐富的NDV 受體---唾液酸殘基結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。由于癌細(xì)胞缺乏抗病毒、凋亡途徑和Ⅰ型INF信號(hào)傳導(dǎo)通路，NDV選擇性地只能在癌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而不感染正常細(xì)胞，因而能廣泛殺傷癌細(xì)胞，而不會(huì)傷及人類正常組織。此外，新城疫病毒使腫瘤細(xì)胞裂解后釋放腫瘤特異性抗原，一定程度上能刺激免疫細(xì)胞活化而誘導(dǎo)腫瘤免疫反應(yīng)。

既往專利報(bào)道新城疫病毒NDV殺傷力不強(qiáng)，抗癌作用尚不甚理想，靶向性差和基因藥物組織特異性表達(dá)不理想。目前實(shí)體腫瘤治療療效差的原因之一就是藥物無(wú)法進(jìn)入腫瘤內(nèi)部。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種熔化腫瘤物理屏障病毒及其應(yīng)用（一種熔化腫瘤物理屏障的靶向超敏廣譜溶瘤病毒及其制備和應(yīng)用）。

本發(fā)明提供了一種包含重組新城疫病毒NDV-GHF質(zhì)粒的重組病毒，所述重組病毒由重組新城疫病毒NDV-GHF質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞拯救獲得。

本發(fā)明中所述包含重組新城疫病毒NDV-GHF質(zhì)粒的重組病毒是指包含重組新城疫病毒NDV、超敏基因α-1,3 GT、溶解細(xì)胞外基質(zhì)的乙酰肝素酶基因HPSE和靶向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的FAP scFv基因（NDV- GT-HPSE-FAP scFv，簡(jiǎn)稱NDV-GHF）質(zhì)粒的重組病毒。

所述輔助質(zhì)粒包括N、P、L等。

所述N具體指表達(dá)NDV的NP蛋白的質(zhì)粒。