[發明專利]一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法

有效

• 申請號: 202111259682.4
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113917140B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 付康
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 覃蛟

本發明公開了一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法，涉及蛋白原核表達系統領域。本發明將熱激后的感受態細胞直接與誘導劑混合，而后將二者的混合液涂布于含有抗生素的平板上，可以同時節省活化的時間和檢測的時間，縮減了活化后再誘導的冗長步驟、SDS?PAGE檢測和Western?blot等驗證過程。通過改進誘導方法和篩選方法，采用Dot?blot(斑點印記)可以快速實現多個單克隆菌落的鑒定，從而有助于更快速的獲得原核蛋白表達的陽性菌。整個過程僅僅需要2?3天，可以極大程度上縮減工作量以及實驗周期，有利于節約科研人員的寶貴時間。

技術領域

本發明涉及蛋白原核表達系統領域，具體而言，涉及一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法。

背景技術

目前，篩選原核蛋白表達菌的方法是：在得到待轉化質粒后，先將待轉化質粒轉入感受態細胞，培養，挑取單克隆菌斑，進一步活化、誘導目標蛋白的表達，細胞破碎后采用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測和/或Western?blot(蛋白質印記法)驗證等一系列實驗過程。一般需要5-7天，且尚不能保證目的蛋白有表達，需要重新挑斑、檢測、驗證等實驗。若平板上沒有目的菌斑，甚至需要重新轉化，增加了工作量和時間成本。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法以解決上述技術問題。

本發明是這樣實現的：

本發明提供了一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其包括：將熱激后的帶有目標質粒的感受態細胞直接與誘導劑混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培養，然后從平板上挑取多個單克隆菌落分別接種于無抗性培養基中，然后將無抗性培養基中的菌液進行細胞裂解，獲得沉淀液，對沉淀液進行Dot?blot分析以確定陽性菌斑。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述平板上含抗生素的濃度為0.5‰～1‰。

在一種可選的實施方式中，感受態細胞與誘導劑的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布體積為30-100μL。可選地，將部分感受態細胞與誘導劑的混合液涂布至含有抗生素的平板上。

在本發明應用較佳的實施方式中，每100ul帶有目標質粒的感受態細胞與終濃度為0.5mM-2mM的誘導劑混合。

在一種可選的實施方式中，感受態細胞為大腸桿菌感受態細胞。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述誘導劑選自IPTG、TMG或ONPG。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述對菌液進行細胞裂解獲得沉淀液的方法包括：采用超聲細胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、熱休克法或化學裂解液法使得菌液的細胞破碎，然后離心得到沉淀物，經緩沖液溶解沉淀后獲得沉淀液。

在一種可選的實施方式中，緩沖液為8-10M的尿素溶液。

在本發明應用較佳的實施方式中，取5-30μL的菌液進行細胞裂解。

在一種可選的實施方式中，裂解是在0-4℃下超聲15-20min，然后進行離心收集沉淀物。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述對沉淀液進行Dot?blot分析包括：將沉淀液直接點在PVDF膜上，干燥后，進行封閉，依次與一抗和二抗孵育，曝光。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述方法還包括：根據曝光的結果判斷菌株是否表達目的蛋白。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述一抗為小鼠抗6×His單克隆抗體，二抗為山羊抗小鼠IgG。

在本發明應用較佳的實施方式中，上述曝光是采用ECL發光試劑盒或DAB顯色試劑盒。

本發明具有以下有益效果：