[發明專利]一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法

有效

• 申請號: 202111259682.4
• 申請日: 2021-10-28
• 公開（公告）號: CN113917140B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 付康
• 申請（專利權）人: 生工生物工程（上海）股份有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 覃蛟

1.一種快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，其包括：將熱激后的帶有目標質粒的感受態細胞直接與誘導劑混合，混合后涂布于含有抗生素的平板上，培養，然后從平板上挑取多個單克隆菌落分別接種于無抗性培養基中，然后將無抗性培養基中的菌液進行細胞裂解，獲得沉淀液，對沉淀液進行Dot?blot分析以確定陽性菌斑；所述平板上含抗生素的濃度為0.5‰~1‰。

2.根據權利要求1所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，感受態細胞與誘導劑的混合液涂布至含有抗生素的平板上的涂布體積為30-100μL。

3.根據權利要求1所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，每100μl所述帶有目標質粒的感受態細胞與終濃度為0.5mM-2mM的所述誘導劑混合。

4.根據權利要求3所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述感受態細胞為大腸桿菌感受態細胞。

5.根據權利要求3所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述誘導劑選自異丙基巰基半乳糖、巰甲基半乳糖苷、?O-硝基半乳糖苷、阿拉伯糖、色氨酸或磷酸鹽。

6.根據權利要求1所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，對菌液進行細胞裂解獲得沉淀液的方法包括：采用超聲細胞破碎法、SDS法、溶菌酶法、熱休克法或化學裂解液法使得菌液的細胞破碎，然后離心得到沉淀物，經緩沖液溶解沉淀后獲得沉淀液。

7.根據權利要求6所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述緩沖液為8-10M的尿素溶液。

8.根據權利要求6所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，取5-30μL的菌液進行細胞裂解。

9.根據權利要求8所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述裂解是在0-4℃下超聲15-20min，然后進行離心收集沉淀物。

10.根據權利要求1所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，對沉淀液進行Dot?blot分析包括：將所述沉淀液直接點在PVDF膜上，干燥后，進行封閉，依次與一抗和二抗孵育，曝光。

11.根據權利要求10所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述方法還包括：根據曝光的結果判斷菌株是否表達目的蛋白。

12.根據權利要求10所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述一抗為小鼠抗6×His單克隆抗體，所述二抗為山羊抗小鼠IgG。

13.根據權利要求10所述的快速篩選原核蛋白表達菌的方法，其特征在于，所述曝光是采用ECL發光試劑盒或DAB顯色試劑盒。