[發明專利]一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 202111243915.1
• 申請日: 2021-10-25
• 公開（公告）號: CN113774083A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 鄺劉輝;李琪;吳德志;張國平
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895
• 代理公司: 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 蔡鼎

本發明公開了一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法，步驟如下：S1、選取長度為0.5?1.0 mm的海大麥幼胚，用酒精和次氯酸鈉雙重表面殺菌，獲得無菌外植體；S2、準確分離整個幼胚，對幼胚進行橫切，以抑制實生幼芽，誘導愈傷組織的發生和增殖；S3、根據愈傷發生和農桿菌生長情況，調整預培養和農桿菌侵染時間，防止菌液過量；S4、采用弱光遮蔽法進行培養，經不定芽誘導培養和根誘導培養，獲得轉基因幼苗。本發明為海大麥幼胚的組培方法，綠點分化和成苗率高，且不受材料限制；建立的海大麥幼胚轉化再生體系，遺傳轉化率和突變效率高。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，特別涉及一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法。

背景技術

小麥族是禾本科中最重要的糧食作物來源之一，全球年產量高達9億噸，占全部谷物產量的30％(FAO，2020)。土壤鹽漬化嚴重制約土地利用與作物生產，是全球農業生產上的一種最主要的非生物脅迫(Munns and Tester,2008,Annu.Rev.Plant Biol.59:651-681)。海大麥(Hordeum marinum)是大、小麥的野生近緣種，是小麥族中耐鹽性最強的物種，且與普通小麥有一定的可交配性，因此是小麥耐鹽性改良的潛在基因供體(Colmer etal.,2006,J.Exp.Bot.57(5):1059-1078；Islam et al.,2007,J.Exp.Bot.58(5):1219-1229)。解析海大麥特異的耐鹽分子機制對優異遺傳(基因)資源的利用和小麥耐鹽性改良具有重要意義。然而，由于海大麥遺傳轉化體系尚未建立，目前對其耐鹽機理研究和基因功能解析進展仍十分緩慢。

小麥族作物的轉基因體系一般采取以幼胚為外植體的農桿菌介導的轉化方法，比如六倍體小麥(Hayta et al.,2019Plant Methods.15:121)和大麥(Bartlett et al.,2008,Plant Methods.4:22)。然而在海大麥中還未見有成功的報道，主要原因是一直缺乏合適的再生體系。高效遺傳轉化體系的建立可為深入開展海大麥優異耐鹽基因的功能解析和育種提供有效途徑。

發明內容

基于此，有必要針對海大麥遺傳轉化體系缺失的現狀，本發明的主要目的是提供一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法，該方法實現了遺傳轉化技術在海大麥中的成功應用，并獲得了較高的轉化率，可應用于海大麥基因功能研究。

本發明的主要目的是通過以下技術方案實現的：

一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法，所述方法包括如下步驟：

S1、海大麥幼胚材料的選取和滅菌：選擇長度為0.5-1.0mm的海大麥幼胚，用酒精和次氯酸鈉雙重表面殺菌，獲得無菌外植體；

S2、幼胚的分離與愈傷誘導：準確分離整個幼胚，對幼胚進行橫切，抑制實生幼芽，并誘導愈傷組織的發生和增殖；

S3、農桿菌侵染與選擇培養：根據愈傷發生和農桿菌生長情況，調整預培養和農桿菌侵染時間，防止菌液過量；

選擇培養用的培養基中添加特泯菌和潮霉素；

S4、愈傷的分化、成苗和陽性苗檢測：采用弱光遮蔽法進行培養，經不定芽誘導培養和根誘導培養，對獲得的組培苗進行DNA提取和PCR檢測。

本發明提供一種農桿菌介導的海大麥遺傳轉化方法和相應的組織培養體系。

作為優選，S1、海大麥幼胚材料的選取和滅菌：選擇未成熟的種子飽滿、胚乳膠狀，半透明，長度為0.5-1.0mm的海大麥幼胚，保留麥芒保持幼胚種皮完整，依次用70％酒精滅菌，再用現配次氯酸鈉溶液浸泡，隨后用滅菌水反復沖洗，獲得無菌外植體。

作為優選，S2、幼胚的分離與愈傷誘導：

取S1中的滅菌種子，置于墊有雙層無菌濾紙的培養皿蓋上，背部朝上，麥芒末端遠離操作者；