[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111243915.1
• 申請日: 2021-10-25
• 公開（公告）號: CN113774083A
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄺劉輝;李琪;吳德志;張國平
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895
• 代理公司: 浙江永航聯(lián)科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 蔡鼎

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1、海大麥幼胚材料的選取和滅菌：選擇長度為0.5-1.0 mm的海大麥幼胚，用酒精和次氯酸鈉雙重表面殺菌，獲得無菌外植體；

S2、幼胚的分離與愈傷誘導(dǎo)：準(zhǔn)確分離整個幼胚，對幼胚進(jìn)行橫切，抑制實(shí)生幼芽，并誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生和增殖；

S3、農(nóng)桿菌侵染與選擇培養(yǎng)：根據(jù)愈傷發(fā)生和農(nóng)桿菌生長情況，調(diào)整預(yù)培養(yǎng)和農(nóng)桿菌侵染時間，防止菌液過量；

選擇培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中添加特泯菌和潮霉素；

S4、愈傷的分化、成苗和陽性苗檢測：采用弱光遮蔽法進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)和根誘導(dǎo)培養(yǎng)，對獲得的組培苗進(jìn)行DNA提取和PCR檢測。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于S1、海大麥幼胚材料的選取和滅菌：選擇未成熟的種子飽滿、胚乳膠狀，半透明，長度為0.5-1.0mm的海大麥幼胚，保留麥芒保持幼胚種皮完整，依次用70%酒精滅菌，再用現(xiàn)配次氯酸鈉溶液浸泡，隨后用滅菌水反復(fù)沖洗，獲得無菌外植體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于S2、幼胚的分離與愈傷誘導(dǎo)：

取S1中的滅菌種子，置于墊有雙層無菌濾紙的培養(yǎng)皿蓋上，背部朝上，麥芒末端遠(yuǎn)離操作者；

利用雙鑷子尖端夾持法，左手鑷子尖端夾持固定種子，右手鑷子尖端撕扯麥芒，扯下整個背部種皮，露出整個幼胚；

左手鑷子尖端刺穿1/2胚乳處，并始終固定住種子，右手鑷子尖端傾斜擠壓幼胚上部胚乳，剝離整個幼胚；

將完整幼胚正面朝上，輕柔放于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面，每皿可放80-100個幼胚，用鑷子尖端逐一對幼胚中央進(jìn)行橫切；

22℃黑暗培養(yǎng)7 d，用鑷子尖端去除少數(shù)實(shí)生幼芽，繼續(xù)黑暗培養(yǎng)7 d，再次去除實(shí)生幼芽和質(zhì)地柔軟的非胚性愈傷；更換新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后黑暗培養(yǎng)2-3周；

如需進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染以獲得轉(zhuǎn)基因植株，則按S3操作；

如直接用于愈傷組織誘導(dǎo)，則取S2中黃色致密的胚性愈傷，22℃黑暗培養(yǎng)3-4周，每兩周更換一次不含潮霉素和特泯菌的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而后轉(zhuǎn)到S4。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于S3、農(nóng)桿菌侵染與選擇培養(yǎng)：

取S2中黃色致密的胚性愈傷，在22℃黑暗環(huán)境下預(yù)培養(yǎng)1周；

取直徑大小為2-3 mm的愈傷塊，使用20 μl移液槍吸取農(nóng)桿菌菌液，逐個滴加在愈傷中央包裹整個愈傷，其后立即吸回多余菌液，略微傾斜培養(yǎng)皿置于超凈工作臺，待多余菌液吹干后，換至新的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

共培養(yǎng)36-48 h后，減少愈傷數(shù)目至每皿20-30個，更換兩輪愈傷誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)3-4周。

5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的海大麥遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于：農(nóng)桿菌菌液采用不含抗生素的MG基本培養(yǎng)液，菌液濃度OD₆₀₀ = 0.5-0.6。