[發(fā)明專(zhuān)利]一種視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111232182.1
• 申請(qǐng)日: 2021-10-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113943707A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾玉曉;鄒婷;徐海偉;段平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0797
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0797
• 代理公司: 北京同恒源知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發(fā)明涉及一種視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的篩選方法通過(guò)改良TrypLE消化液以及直接貼壁培養(yǎng)后再分選，提高了細(xì)胞活性，降低細(xì)胞死亡率，分選活性率由40?60％提高到95％以上。分選出的細(xì)胞在改良N2B27神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞擴(kuò)增更加穩(wěn)定，提高了擴(kuò)增代次，由原來(lái)P5能穩(wěn)定提高到P10左右，并保持著視網(wǎng)膜干細(xì)胞活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

視網(wǎng)膜變性疾病(RD)是以視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)元丟失為特點(diǎn)的一類(lèi)嚴(yán)重致盲性眼病。針對(duì)視網(wǎng)膜變性導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡目前尚無(wú)有效的治療手段，干細(xì)胞移植是治療視網(wǎng)膜變性具有前景的治療策略。

視網(wǎng)膜前體細(xì)胞(RPC)是一類(lèi)有治療潛力的干細(xì)胞。以往富集人視網(wǎng)膜前體細(xì)胞多從流產(chǎn)胚胎視網(wǎng)膜，來(lái)源受限，并涉及倫理學(xué)問(wèn)題，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療細(xì)胞來(lái)源。人視網(wǎng)膜類(lèi)器官是經(jīng)人多能干細(xì)胞誘導(dǎo)形成的三維視網(wǎng)膜組織，與在體視網(wǎng)膜發(fā)育高度相似，并且其突破倫理學(xué)限制，在體外較易獲得，有望成為干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性新的種子細(xì)胞來(lái)源。積極開(kāi)發(fā)從人視網(wǎng)膜類(lèi)器官上穩(wěn)定高效富集治療細(xì)胞的策略將為治療視網(wǎng)膜變性疾病提供豐富的治療來(lái)源，是干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病臨床轉(zhuǎn)化的必經(jīng)之路。

前期已經(jīng)證實(shí)通過(guò)表面抗原分選C-kit⁺SSEA4^-細(xì)胞是一群具有治療效果的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。目前從類(lèi)器官中富集這群視網(wǎng)膜前體細(xì)胞采取機(jī)械分離加消化酶分離單細(xì)胞---表面抗體染色---過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)---上機(jī)分選---陽(yáng)性細(xì)胞接種(整個(gè)過(guò)程需要3-4小時(shí)左右)，主要存在以下問(wèn)題：1、視網(wǎng)膜類(lèi)器官神經(jīng)組織消化較困難，分離的細(xì)胞活力低；2、消化后即時(shí)分選的單細(xì)胞總量少，富集到的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少；3、從消化經(jīng)過(guò)染色再分選耗時(shí)較長(zhǎng)，最終分選得到的陽(yáng)性細(xì)胞狀態(tài)差，進(jìn)而導(dǎo)致擴(kuò)增困難。因此，有必要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案來(lái)獲得更多數(shù)量和更高質(zhì)量的C-kit⁺SSEA4^-視網(wǎng)膜前體細(xì)胞來(lái)滿(mǎn)足臨床移植治療。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1、一種視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)方法，所述方法為：

(1)取視網(wǎng)膜類(lèi)器官并分離視網(wǎng)膜神經(jīng)層，將視網(wǎng)膜神經(jīng)層放入改良消化液中37℃消化30分鐘，在消化15分鐘后將未消化散的神經(jīng)層更換另一管新鮮改良消化液，搖晃、輕輕吹打，貼壁培養(yǎng)2天；

(2)取出步驟(1)中貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，只加入TrypLE消化酶3-5分鐘，收集細(xì)胞；

(3)將步驟(2)中收集的細(xì)胞用改良N2B27神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述改良消化液為T(mén)rypLE消化酶中含有0.125％胰蛋白酶。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述改良N2B27神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括D/F12D/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27添加劑、N2添加劑、BFGF和血清替代物。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述D/F12D/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Neurobasal培養(yǎng)基的體積比為1：1。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述B27添加劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％、N2添加劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述改良N2B27神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中BFGF的終濃度為20ng/mL。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，血清替代物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％。

本發(fā)明的有益效果在于：