[發(fā)明專利]Stk11基因敲除細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111219982.X
• 申請日: 2021-10-20
• 公開（公告）號: CN114410685A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單體中;陳文濤;周炎冰;有文靜;徐子葉
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/077;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發(fā)明公開了一種Stk11基因敲除細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和用途。Stk11基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1）根據(jù)小鼠Stk11基因全長序列和pLent?U6?GFP?Puro載體的信息設(shè)計并合成含有Mlu I及BamH I酶切位點(diǎn)的靶向Stk11的引物序列；2）Stk11干擾質(zhì)粒（簡稱pLent?U6?shStk11）的構(gòu)建及其慢病毒制取：3）Stk11基因敲除的C2C12細(xì)胞系構(gòu)建：用制取的pLent?U6?shStk11慢病毒載體轉(zhuǎn)染小C2C12成肌細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲除Stk11基因的C2C12細(xì)胞系。所述的Stk11基因敲除的細(xì)胞系的用途，用于研究敲除Stk11對成肌細(xì)胞融合、分化、肌纖維發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)制，用于藥物篩選和制備。本發(fā)明適合于開展更多和Stk11基因功能相關(guān)的實驗，可用于藥物篩選和制備，應(yīng)用前景廣泛。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Stk11 (serine/threonine kinase 11)基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法和用途，屬于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)

Stk11（又叫Lkb1）在哺乳動物多種組織中廣泛表達(dá)，在骨骼肌組織中表達(dá)量較高。Stk11基因突變與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，因此被認(rèn)為是抑癌基因。Stk11基因編碼的蛋白質(zhì)是重要的蛋白激酶，在體內(nèi)發(fā)揮多種生理功能，參與調(diào)控肌肉發(fā)育、脂肪生成、細(xì)胞生長、能量代謝和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。

Stk11基因可能與肌內(nèi)脂肪沉積、肌細(xì)胞分化和融合及肌纖維形成相關(guān)，但目前關(guān)于Stk11基因調(diào)控肌纖維發(fā)育和肌內(nèi)脂質(zhì)代謝的機(jī)制鮮見報道，也未有Stk11基因敲除的相關(guān)細(xì)胞系。比如通過敲除動物模型研究，體外細(xì)胞實驗每次需要分離原代肌衛(wèi)星細(xì)胞，繁瑣周期長、不易操作，成功率低。

因此，構(gòu)建Stk11基因敲除的成肌（myoblast）細(xì)胞系并研究其在調(diào)控肌細(xì)胞的增殖、分化和融合及肌內(nèi)脂肪沉積等過程中的功能具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供一種Stk11基因敲除細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和用途。

一種Stk11基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1）根據(jù)小鼠Stk11基因全長序列和pLent-U6-GFP-Puro載體的信息設(shè)計并合成含有Mlu I及BamH I酶切位點(diǎn)的靶向Stk11的引物序列；正義寡核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；

反義寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

2）Stk11干擾質(zhì)粒（簡稱pLent-U6-shStk11）的構(gòu)建及其慢病毒制取：將1）Stk11的shRNA引物退火反應(yīng)形成互補(bǔ)雙鏈，然后將退火產(chǎn)物用Mlu I和BamH I雙酶切，再與雙酶切后的pLent-U6質(zhì)粒連接，構(gòu)建Stk11干擾質(zhì)粒（pLent-U6-shStk11），轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并挑選單克隆菌PCR和測序鑒定；將陽性克隆菌質(zhì)粒提取后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將12μg pLent-U6-shStk11和9 μg pSPAX.2及3.5 μg pMD2.G共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，48h后獲得pLent-U6-shStk11慢病毒載體；

3）Stk11基因敲除的C2C12細(xì)胞系構(gòu)建：用制取的pLent-U6-shStk11慢病毒載體轉(zhuǎn)染小C2C12成肌細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定敲除Stk11基因的C2C12細(xì)胞系。

步驟2）所得的pLent-U6-shStk11慢病毒載體進(jìn)行鑒定：

轉(zhuǎn)染密度為70%~80%的293T細(xì)胞，48 h后用收集細(xì)胞，提取總蛋白并用Westernblot 法檢測目的蛋白Stk11和內(nèi)參GAPDH蛋白表達(dá)情況。

一種根據(jù)所述的構(gòu)建方法得到的Stk11基因敲除細(xì)胞系。

一種根據(jù)所述的Stk11基因敲除的細(xì)胞系的用途，用于研究敲除Stk11對成肌細(xì)胞融合、分化、肌纖維發(fā)育及相關(guān)基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)制，用于藥物篩選和制備。