[發明專利]Stk11基因敲除細胞系及其構建方法和用途

在審

• 申請號: 202111219982.X
• 申請日: 2021-10-20
• 公開（公告）號: CN114410685A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 單體中;陳文濤;周炎冰;有文靜;徐子葉
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10;C12N5/077;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

1.一種Stk11基因敲除細胞系的構建方法，其特征是：包括以下步驟：

1）根據小鼠Stk11基因全長序列和pLent-U6-GFP-Puro載體的信息設計并合成含有MluI及BamH I酶切位點的靶向Stk11的引物序列；正義寡核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反義寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

2）Stk11干擾質粒（簡稱pLent-U6-shStk11）的構建及其慢病毒制取：將1）Stk11的shRNA引物退火反應形成互補雙鏈，然后將退火產物用Mlu I和BamH I雙酶切，再與雙酶切后的pLent-U6質粒連接，構建Stk11干擾質粒（pLent-U6-shStk11），轉化大腸桿菌，并挑選單克隆菌PCR和測序鑒定；將陽性克隆菌質粒提取后，采用脂質體轉染法將12μg pLent-U6-shStk11和9 μg pSPAX.2及3.5 μg pMD2.G共轉染到293T細胞中，48h后獲得pLent-U6-shStk11慢病毒載體；

3）Stk11基因敲除的C2C12細胞系構建：用制取的pLent-U6-shStk11慢病毒載體轉染小C2C12成肌細胞，通過嘌呤霉素篩選獲得穩定敲除Stk11基因的C2C12細胞系。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征是：步驟2）所得的pLent-U6-shStk11慢病毒載體進行鑒定：

轉染密度為70%~80%的293T細胞，48 h后用收集細胞，提取總蛋白并用Western blot法檢測目的蛋白Stk11和內參GAPDH蛋白表達情況。

3.一種根據權利要求1所述的構建方法得到的Stk11基因敲除細胞系。

4.一種根據權利要求3所述的Stk11基因敲除的細胞系的用途，其特征是：用于研究敲除Stk11對成肌細胞融合、分化、肌纖維發育及相關基因表達與調控機制，用于藥物篩選和制備。

5.根據權利要求4所述的用途，其特征是：Stk11基因敲除下調細胞中肌細胞融合基因。

6.根據權利要求4所述的用途，其特征是：Stk11基因敲除下調細胞中MyHC的表達量。