[發明專利]以Bx-tlp-2為靶基因檢測松材線蟲的LAMP引物組及LAMP檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202111216490.5
• 申請日: 2021-10-19
• 公開（公告）號: CN113862377A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發明（設計）人: 孟繁麗;劉振凱;理永霞;張星耀
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了一種以Bx?tlp?2為靶基因檢測松材線蟲的LAMP引物組及LAMP檢測試劑盒。本發明以松材線蟲Bx?tlp?2基因作為松材線蟲LAMP檢測的靶標基因設計多對LAMP檢測引物，通過大量的篩選試驗最終篩選得到了特異性強、檢測效率高的LAMP引物組。在此基礎上，本發明提供了檢測松材線蟲的LAMP檢測方法以及LAMP試劑盒。本發明提供的LAMP檢測方法以及檢測試劑盒具有操作簡便、成本低、穩定性高、特異性強、檢測效率高等優點，在松材線蟲檢測中具有應用前景。

技術領域

本發明涉及檢測植物線蟲的試劑盒，尤其涉及一種檢測松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)的LAMP檢測引物、檢測方法及LAMP檢測試劑盒，屬于松材線蟲的檢測領域。

背景技術

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲侵染引發的一種毀滅性松林病害。松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus(SteinerBuhrer)(Nickle WR,Golden AM,MamiyaY,et al.On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus(SteinerBuhrer1934) Nickle 1970.Journal ofNematology,1981,13:385-392.)屬于線形動物門、滑刃目Aphelenchida、滑刃科Aphelenchoididae、傘滑刃屬Bursaphelenchus。感染松材線蟲的松樹樹脂分泌逐漸減少，針葉先是褪色和黃化，進而枯萎變成紅褐色，最終全株死亡。松樹在感染松材線蟲后發病迅速，30-90天即可導致松樹完全枯死，致死率極高，3-5年即可造成大面積林分死亡。因松材線蟲致死的松樹針葉不會脫落，大面積死亡的松林呈現出一片紅褐色，如同正在肆虐的火災持續蔓延，被稱為“無煙的森林火災”(于海英, 吳昊,張旭東等.落葉松自然條件下感染松材線蟲初報.中國森林病蟲, 2019,38(4):7-10；于海英,吳昊,黃瑞芬等.遼寧撫順樟子松松材線蟲分離與鑒定.中國森林病蟲,2020,39(2):6-10.)。

松材線蟲病自1982年傳入中國以來，在中國快速傳播擴散，目前已在全國19個省(區、市)，700多個縣級行政區，約3000個鄉鎮發生松材線蟲病疫情，累計造成超過9000萬株松樹死亡，年均直接經濟損失數十億元。特別是近年來，松材線蟲病在中國發生形勢發生重大變化，疫情向北擴散蔓延勢頭迅猛，疫情危害形勢更加嚴峻，已入侵黃山、泰山、廬山、張家界、三峽庫區、秦巴山區等多個國家級風景名勝區和重點生態區，對全國約9億畝松樹林木資源構成了嚴重威脅。

形態學是線蟲種類常規鑒定的標準方法，松材線蟲的鑒定主要依靠成蟲的形態特征。但是通過形態學準確鑒定松材線蟲成蟲對于非專業人員相當困難，且無法對幼蟲進行準確鑒定。由于形態學的限制，免疫學、生理生化和分子生物學方法被應用到松材線蟲的鑒定上(王明旭.松材線蟲分子生物學檢測技術研究進展.湖南林業科技,2004,31(2):1-3；陳鳳毛,葉建仁,吳小芹等.松材線蟲SCAR標記與檢測技術.林業科學,2012,48(3): 88-94.)。目前，松材線蟲的檢測與鑒定主要以分子生物學的方法為主。其中，DNA探針技術雖能有效地鑒定松材線蟲，但費用較高，具有放射性；RAPD技術分析松材線蟲與近似種的關系結果重復性較差；RFLP技術區分松材線蟲和擬松材線蟲，內切酶價格昂貴、耗時；熒光PCR靈敏、快速，但較昂貴；PCR技術操作簡便、花費較少，但所需時間也較長。