[發(fā)明專利]以Bx-tlp-2為靶基因檢測松材線蟲的LAMP引物組及LAMP檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111216490.5
• 申請日: 2021-10-19
• 公開（公告）號: CN113862377A
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟繁麗;劉振凱;理永霞;張星耀
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.用于檢測松材線蟲的LAMP引物組，其特征在于，選自以下5組LAMP引物組中的任意一組：

2號LAMP引物組：由一對外引物對，一對內(nèi)引物對和一對環(huán)引物對組成，其中，所述外引物對由上游外部引物SEQ ID NO.7和下游外部引物SEQ ID NO.8組成，所述內(nèi)引物對由上游內(nèi)部引物SEQ ID NO.9和下游內(nèi)部引物SEQ ID NO.10組成，所述環(huán)引物對由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的環(huán)引物組成；

3號LAMP引物組：由一對外引物對，一對內(nèi)引物對和一對環(huán)引物對組成，其中，所述外引物對由上游外部引物SEQ ID NO.13和下游外部引物SEQ ID NO.14組成，所述內(nèi)引物對由上游內(nèi)部引物SEQ ID NO.15和下游內(nèi)部引物SEQ ID NO.16組成，所述環(huán)引物對由SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18所示的環(huán)引物組成；

4號LAMP引物組：由一對外引物對，一對內(nèi)引物對和一對環(huán)引物對組成，其中，所述外引物對由上游外部引物SEQ ID NO.19和下游外部引物SEQ ID NO.20組成，所述內(nèi)引物對由上游內(nèi)部引物SEQ ID NO.21和下游內(nèi)部引物SEQ ID NO.22組成，所述環(huán)引物對由SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示的環(huán)引物組成；

5號LAMP引物組：由一對外引物對，一對內(nèi)引物對和一對環(huán)引物對組成，其中，所述外引物對由上游外部引物SEQ ID NO.25和下游外部引物SEQ ID NO.26組成，所述內(nèi)引物對由上游內(nèi)部引物SEQ ID NO.27和下游內(nèi)部引物SEQ ID NO.28組成，所述環(huán)引物對由SEQ IDNO.29和SEQ ID NO.30所示的環(huán)引物組成。

6號LAMP引物組：由一對外引物對，一對內(nèi)引物對和一對環(huán)引物對組成，其中，所述外引物對由上游外部引物SEQ ID NO.31和下游外部引物SEQ ID NO.32組成，所述內(nèi)引物對由上游內(nèi)部引物SEQ ID NO.33和下游內(nèi)部引物SEQ ID NO.34組成，所述環(huán)引物對由SEQ IDNO.35和SEQ ID NO.36所示的環(huán)引物組成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的LAMP引物組，其特征在于，所述的LAMP引物組是5號LAMP引物組。

3.權(quán)利要求1或2所述的LAMP引物組在檢測松材線蟲中的應(yīng)用。

4.一種檢測松材線蟲的LAMP檢測方法，其特征在于，包括：

(1)從待檢測的松樹樣品中提取松材線蟲DNA；(2)以提取的DNA為模板加入包括LAMP引物組、Bst DNA聚合酶在內(nèi)的組分建立LAMP反應(yīng)體系，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；(3)于63℃45s處收集熒光信號，若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，即有核酸擴(kuò)增；若無“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性，即無核酸擴(kuò)增。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的LAMP檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?3℃15s，63℃45s作為一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的LAMP檢測方法，其特征在于，所述的松樹是任何一種被松材線蟲侵染的松樹，包括但不限于：馬尾松、白皮松、樟子松、五針?biāo)伞⒑谒伞⒓t松、油松、喬松、赤松、琉球松、歐洲黑松、海岸松、歐洲山松、輻射松、西黃松、西部白松、中國臺灣黑松、濕地松、剛松、扭葉松、北美喬松、火炬松、長葉松、北美短葉松、刺葉松或加勒比松。

7.一種檢測松材線蟲的LAMP試劑盒，該試劑盒包括：LAMP引物組，LAMP反應(yīng)緩沖液，BstDNA聚合酶，dNTPs和熒光染料；其特征在于，所述的LAMP引物組是權(quán)利要求1所述的LAMP引物組。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的LAMP試劑盒，其特征在于，所述的熒光染料是SYBR GreenI。

9.權(quán)利要求8或9所述的LAMP試劑盒在檢測松材線蟲中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：(1)從待檢測的松樹樣品中提取待檢測樣品的DNA，以該DNA為模板建立LAMP反應(yīng)體系；(2)將LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；(3)于63℃45s處收集熒光信號，若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽性，即有核酸擴(kuò)增；若無“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性，即無核酸擴(kuò)增。